微生物在自然生長和發(fā)酵生產過程中經常會面臨脅迫環(huán)境,抑制菌體生長并且降低發(fā)酵產物的產量。通過調節(jié)轉錄因子的表達來抵御環(huán)境脅迫已經成為一種有效的策略。本論文以一株光滑球擬酵母Candida glabrata ATCC 55為研究對象,以解析光滑球擬酵母抵御鹽脅迫和酸脅迫的生理機制為研究目的,利用分子生物學和生物化學等分析方法,就轉錄因子CgRds2應答鹽脅迫和酸脅迫的生理機制展開研究,主要結果如下:1.采用基因敲除和回補表達的方法構建了敲除菌株Cgrds2Δ和回補菌株Cgrds2Δ/CgRDS2,發(fā)現:在1.5 M NaCl條件下,與出發(fā)菌株wt相比,敲除菌株Cgrds2Δ的細胞濃度和細胞存活率分別降低了23.4%和39.6%,而回補菌株Cgrds2Δ/CgRDS2的細胞濃度和細胞存活率分別提高了10.2%和6.3%;在pH 2.0條件下,與出發(fā)菌株wt相比,敲除菌株Cgrds2Δ的細胞濃度和細胞存活率分別降低了32.6%和56.9%,而回補菌株Cgrds2Δ/CgRDS2的細胞濃度沒有顯著變化,但細胞存活率提高了17.6%。2.通過轉錄組數據分析發(fā)現,鹽脅迫下敲除菌株Cgrds2Δ中糖酵解、核糖體生物合成和rRNA轉錄等路徑中基因的轉錄水平顯著上調;脂質代謝、MAPK信號傳導和細胞周期等路徑中基因的轉錄水平顯著下調,其中脂質代謝路徑中甘油磷脂代謝基因的表達量變化最為顯著。進一步研究鹽脅迫下CgRds2的調控機制發(fā)現,MAPK路徑中的關鍵激酶CgHog1能夠與轉錄因子CgRds2發(fā)生相互作用,并且CgHog1通過磷酸化CgRds2的Ser64和Thr97兩個位點激活轉錄因子CgRds2。最后,CgHog1介導CgRds2調節(jié)甘油磷脂基因的表達、甘油磷脂組分和細胞膜完整性。在1.5 M NaCl條件下,與出發(fā)菌株wt相比,敲除菌株Cgrds2Δ中甘油磷脂基因的轉錄水平顯著降低,總磷脂含量和細胞膜完整性分別降低了30.3%和47.6%,而回補菌株Cgrds2Δ/CgRDS2中總磷脂含量和細胞膜完整性分別提高了27.2%和12.1%;磷酸化位點突變菌株Cgrds2~(2A)中Cg Rds2與甘油磷脂基因的結合程度顯著降低,總磷脂含量和細胞膜完整性分別降低了29.4%和21.8%。3.通過轉錄組數據分析發(fā)現,酸脅迫下敲除菌株Cgrds2Δ中減數分裂、蛋白質轉運和轉錄過程等路徑中基因的轉錄水平顯著上調;翻譯過程、細胞膜生物合成、氨基酸代謝和能量代謝等路徑中基因的轉錄水平顯著下調。進一步研究酸脅迫下CgRds2的調控機制發(fā)現,鈣離子響應路徑中的鈣調磷酸激酶CgCmk1能夠與轉錄因子CgRds2的PAS結構域發(fā)生相互作用,激活轉錄因子CgRds2的表達,使其從細胞質轉移到細胞核中發(fā)揮作用。最后,CgCmk1介導CgRds2調節(jié)能量代謝基因的表達、胞內ATP含量和細胞膜通透性。在pH 2.0條件下,與出發(fā)菌株wt相比,敲除菌株Cgrds2Δ中能量代謝基因的轉錄水平顯著降低,胞內ATP含量和細胞膜通透性分別降低了33.5%和23.6%,而回補菌株Cgrds2Δ/CgRDS2中胞內ATP含量和細胞膜通透性分別提高了41.5%和18.8%;PAS結構域缺失菌株Cgrds2-pas中CgRds2與能量代謝基因的結合程度顯著降低,胞內ATP含量和細胞膜通透性分別降低了30.7%和19.1%。
【學位單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：TQ920.1
【部分圖文】：

圖 1-1 膜組分對細胞膜理化性質的影響ig. 1-1 Physical membrane properties are influenced by lipid composit御環(huán)境脅迫的研究現狀和工業(yè)發(fā)酵過程中，微生物常常面臨高溫、滲透壓、活。細胞膜作為保護細胞內部環(huán)境的第一道屏障，對于細（1）高溫會嚴重影響細胞內正常有序的生理機制。高溫的信號感受器，通過一系列的信號傳導路徑降低 Δ9 去平，并且觸發(fā)脂肪酸合成酶基因 FAS2 的表達，使得飽和而降低細胞膜的流動性，對熱脅迫環(huán)境做出響應[15]。（2致滲透壓脅迫，緩解滲透壓脅迫并提高目標產物的產量研究表明，滲透壓脅迫下，細胞內不飽和脂肪酸（UFA溫度降低，從而使細胞膜流動性增加[16]。（3）氧脅迫是吸收活性氧之間不平衡而造成的一種脅迫環(huán)境。研究表解氧脅迫的有效策略。例如，過表達麥角甾醇合成路徑麥角甾醇的合成，降低細胞膜對過氧化氫的通透性，從

圖 1-2 鋅指轉錄因子 DNA 結合結構域Fig. 1-2 Structure of DNA-binding domains of zinc cluster transcription factor亮氨酸拉鏈轉錄因子包括 Sko1、Yap1 等。釀酒酵母中轉錄因子 Yap1 通過調節(jié)G15 的表達控制細胞內磷脂含量[41]。轉錄因子 Yap1 能夠結合在基因 ATG15 的啟域，敲除轉錄因子 Yap1 會降低基因 ATG15 的轉錄水平。利用免疫沉淀結合磷脂鑒定出基因ATG15的編碼蛋白是一種磷脂酶，促進磷脂在sn-1的位置發(fā)生水解反 同位素示蹤法檢測基因 ATG15 敲除菌株中磷脂含量發(fā)現，PC、PE、PI 和 PS 的著降低，而過表達基因 ATG15 后，PC、PE、PI 和 PS 的含量顯著增加。磷脂酶 A功能部分依賴于轉錄因子 Yap1 的調節(jié)，因此轉錄因子 Yap1 能夠參與細胞內磷脂調節(jié)。轉錄因子 Sko1 參與抵御膜脂合成受損引發(fā)的脅迫環(huán)境。在白色念珠菌Gpil4 是糖基磷脂酰肌醇（GPI）合成路徑中甘露糖轉移酶的催化亞基，缺失 CaG導致 GPI 合成受損，進而激活 HOG 脅迫響應路徑以及其下游轉錄因子 CaSko1 42]，從而對脅迫環(huán)境做出響應，但具體的調節(jié)機制還不清楚。在釀酒酵母中，鞘合成受損同樣會觸發(fā) HOG 路徑，轉錄因子 Sko1 也參與響應鞘脂合成受損造成的境[43]。螺旋-突環(huán)-螺旋轉錄因子和螺旋-轉角-螺旋轉錄因子的DNA結合域結構均由α

導入出發(fā)菌株CgHTUΔ 中，在缺乏組氨酸的 YNB 平板上篩選轉化子并進行菌落 PCR 驗證，結果如圖3-1D 所示。提取陽性轉化子的基因組，以此為模板擴增敲除框片段，測序正確的突變株則為基因 CgRDS2 敲除菌株，命名為 Cgrds2Δ。圖 3-1 敲除菌株 Cgrds2Δ 的構建與驗證Fig. 3-1 Construction and verification of the Cgrds2Δ strain注：（A）擴增 CgRds2 敲除框的三個片段：左臂 L、標記基因組氨酸 H 和右臂 R；（B）融合 PCR 構建敲除框 LHR；（C）pMD19-LHR 菌落 PCR：泳道 1 和 2 為陽性轉化子，+為敲除框片段，-為陰性轉化子；（D）酵母轉化子菌落 PCR：泳道 1 和 2 為陽性轉化子，-為陰性對照。以光滑球擬酵母 CgHTUΔ 的基因組為模板，擴增帶有酶切位點的基因 CgRDS2，得到大小為 1395 bp 的片段

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本文編號：2807675