【摘要】：環(huán)β-1,2-葡聚糖是以葡萄糖為單體,經(jīng)β-1,2-糖苷鍵連接的聚合度位于17~40之間的具有較強(qiáng)水溶性的環(huán)形多糖。環(huán)β-1,2-葡聚糖在植物根瘤形成、布魯氏菌免疫逃逸等過(guò)程中起著重要作用。獲得足量的環(huán)β-1,2-葡聚糖是分析其詳細(xì)功能及作用機(jī)制的基礎(chǔ)。但是目前尚沒(méi)有大量獲得環(huán)β-1,2-葡聚糖的有效方法與途徑。針對(duì)該問(wèn)題,本文以生物安全菌株放射型根瘤菌(Rhizobium radiobacter ATCC 1333)為研究對(duì)象,通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基、條件和發(fā)酵工藝,探索強(qiáng)化環(huán)β-1,2-葡聚糖合成的策略,對(duì)發(fā)酵液中的多糖進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)解析,并對(duì)NaNO_3強(qiáng)化環(huán)葡聚糖合成與分泌的發(fā)酵工藝與分子機(jī)制進(jìn)行了初探,主要研究如下:(1)優(yōu)化發(fā)酵法合成胞外環(huán)葡聚糖產(chǎn)量,首先對(duì)8種氮源和6種碳源進(jìn)行初選,并對(duì)培養(yǎng)基成分進(jìn)行單因素優(yōu)化;然后設(shè)計(jì)Plackett-Burman試驗(yàn),篩選出顯著影響胞外環(huán)葡聚糖產(chǎn)量的因素;最后采用四因素五水平的響應(yīng)面優(yōu)化法實(shí)現(xiàn)胞外環(huán)葡聚糖產(chǎn)量的最大化。優(yōu)化得到最佳發(fā)酵條件為:甘露醇23.0 g·L~(-1)、谷氨酸3.5 g·L~(-1)、NaCl 0.2 g·L~(-1)、溫度32℃,該條件下胞外環(huán)葡聚糖產(chǎn)量為1.78 g·L~(-1),與優(yōu)化前相比,胞外環(huán)葡聚糖產(chǎn)量提高了206.9%。(2)針對(duì)高濃度谷氨酸使發(fā)酵液顏色發(fā)生褐化、造成細(xì)胞濃度無(wú)法提高,進(jìn)而影響環(huán)葡聚糖合成的問(wèn)題,提出pH調(diào)控策略。在7 L反應(yīng)器的基礎(chǔ)上建立通過(guò)調(diào)控pH結(jié)合谷氨酸補(bǔ)料抑制褐變的發(fā)生來(lái)提高細(xì)胞濃度的發(fā)酵控制策略。并提出pH兩階段控制策略,生長(zhǎng)期將pH控制在7.0,產(chǎn)糖期控制pH為5.5,同時(shí)間歇補(bǔ)充氮源,從而成功抑制了發(fā)酵液褐化的現(xiàn)象,并將細(xì)胞濃度提高到6.36 g·L~(-1),環(huán)葡聚糖濃度提高到2.79g·L~(-1);另外結(jié)合溶氧控制策略,進(jìn)一步將細(xì)胞濃度增加至8.94 g·L~(-1),環(huán)葡聚糖產(chǎn)量達(dá)到2.94 g·L~(-1),菌體的生產(chǎn)強(qiáng)度為0.34 g·g~(-1),較優(yōu)化前細(xì)胞濃度提高了138.3%,環(huán)葡聚糖的產(chǎn)量提高了61.5%。(3)確定發(fā)酵液中多糖組分的精細(xì)結(jié)構(gòu)。對(duì)經(jīng)pH調(diào)控后的發(fā)酵多糖產(chǎn)物進(jìn)行提取純化,結(jié)合乙醇分級(jí)沉淀、固相萃取法以及高效液相法進(jìn)行純化制備,利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜、單糖組成分析、電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜、傅里葉紅外光譜和核磁共振手段對(duì)發(fā)酵部分多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析,確定這部分多糖主要有兩個(gè)組分:組分Ⅰ是酸性多糖,由七個(gè)葡萄糖和一個(gè)半乳糖組成,含有丙酮酸和琥珀酸取代基;組分Ⅱ是以葡萄糖為單體,通過(guò)β-1,2-糖苷鍵連接的環(huán)葡聚糖,聚合度分布為17~22,主要以19個(gè)聚合度為主,無(wú)支鏈結(jié)構(gòu)。(4)發(fā)現(xiàn)NaNO_3作為氮源有利于環(huán)葡聚糖的胞外分泌,并在此基礎(chǔ)上提出谷氨酸-NaNO_3補(bǔ)料策略,使得環(huán)葡聚糖的胞外分泌量大增。然后利用雙向電泳技術(shù)對(duì)兩種氮源發(fā)酵的菌體中胞內(nèi)蛋白進(jìn)行差異分析,主要差異蛋白涉及無(wú)機(jī)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、胞外多糖合成、能量代謝以及氧化還原等功能,且ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)對(duì)環(huán)葡聚糖的合成以及胞外分泌有著至關(guān)重要的作用。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：TQ929
【圖文】：

級(jí)沉淀組分的薄層層析驗(yàn)證以及 MALDI-TOF MS 驗(yàn)證(a：TLC 驗(yàn)證圖沉淀 2；b：沉淀 1 的 MALDI-TOF MS 圖；c：沉淀 2 的 MALDI-TOF M6 The verification of fermentation fractionated precipitation components by phy and MALDI-TOF MS ( a is the TLC graph, 1 is precipitate 1, 2 is precipMALDI-TOF MS of precipitated 1; c is the MALDI MS of precipitated 2) 法分離沉淀 2PLC 法對(duì)多糖組分沉淀 2 進(jìn)行檢測(cè)分析，分析方法如 2.4.3。主-17a)，并對(duì)各個(gè)峰收集，進(jìn)行 TLC 驗(yàn)證(圖 3-17b)。圖 3-17 HPLC 的譜圖(a)以及各峰組分的 TLC 驗(yàn)證(b)

級(jí)沉淀組分的薄層層析驗(yàn)證以及 MALDI-TOF MS 驗(yàn)證(a：TLC 驗(yàn)證圖沉淀 2；b：沉淀 1 的 MALDI-TOF MS 圖；c：沉淀 2 的 MALDI-TOF M6 The verification of fermentation fractionated precipitation components by phy and MALDI-TOF MS ( a is the TLC graph, 1 is precipitate 1, 2 is precipMALDI-TOF MS of precipitated 1; c is the MALDI MS of precipitated 2) 法分離沉淀 2PLC 法對(duì)多糖組分沉淀 2 進(jìn)行檢測(cè)分析，分析方法如 2.4.3。主-17a)，并對(duì)各個(gè)峰收集，進(jìn)行 TLC 驗(yàn)證(圖 3-17b)。

b：沉淀 1 的 MALDI-TOF MS 圖；c：沉淀 2 的 MALDrification of fermentation fractionated precipitation compoMALDI-TOF MS ( a is the TLC graph, 1 is precipitate 1, 2I-TOF MS of precipitated 1; c is the MALDI MS of precip沉淀 2對(duì)多糖組分沉淀 2 進(jìn)行檢測(cè)分析，分析方法如 并對(duì)各個(gè)峰收集，進(jìn)行 TLC 驗(yàn)證(圖 3-17b)。圖 3-17 HPLC 的譜圖(a)以及各峰組分的 TLC 驗(yàn)證(b)17 HPLC chromatograms (a) and TLC verification of each

【參考文獻(xiàn)】

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1 王德偉;游景水;葉禮紅;葉少文;;高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法快速測(cè)定益生菌粉中低聚果糖含量[J];食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào);2015年08期

2 欒曉紅;趙峽;王清池;;縊蟶多糖的提取、分離和結(jié)構(gòu)分析[J];中國(guó)海洋藥物;2015年02期

3 張洪濤;朱莉;詹曉北;;基于電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜的藍(lán)藻寡糖脫果糖分析及系列α-1,2-葡聚寡糖的制備[J];高等學(xué)�；瘜W(xué)學(xué)報(bào);2014年12期

4 張洪濤;朱莉;張爽;詹曉北;;基于ESI-CID-MS/MS離子碎片峰特征的香菇多糖水解機(jī)制及系列香菇寡糖的制備[J];高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào);2014年11期

5 管寧;韓建東;李瑾;任海霞;任鵬飛;宮志遠(yuǎn);;天然寡糖的研究進(jìn)展[J];山東農(nóng)業(yè)科學(xué);2013年07期

6 萬(wàn)萍;李會(huì);徐浩;陳飛;徐虹;;溶氧調(diào)控策略對(duì)Alcaligenes sp. NX-3產(chǎn)威蘭膠發(fā)酵過(guò)程的影響[J];食品與發(fā)酵工業(yè);2011年04期

7 張芙華;陳晟;張東旭;華兆哲;陳堅(jiān);吳敬;;pH兩階段控制策略發(fā)酵生產(chǎn)重組角質(zhì)酶[J];中國(guó)生物工程雜志;2008年05期

8 夏朝紅;戴奇;房韋;陳和生;;幾種多糖的紅外光譜研究[J];武漢理工大學(xué)學(xué)報(bào);2007年01期

9 陳玉芹,李小六,李艷梅,姚占芳;高產(chǎn)環(huán)狀β-葡聚糖根瘤菌菌株的快速篩選[J];河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年03期

10 王磊,詹曉北,朱一暉,李珍雨,楊燁;pH控制對(duì)熱凝膠發(fā)酵的影響[J];生物工程學(xué)報(bào);2002年05期

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2 王秀然;布魯氏菌wzm/wzt基因?qū)ζ涠玖�、免疫原性及蛋白質(zhì)表達(dá)影響的研究[D];吉林大學(xué);2014年

3 張洪濤;微生物β-1，3-葡聚糖的強(qiáng)化合成及最小功能單元挖掘[D];江南大學(xué);2011年

4 劉金龍;微生物發(fā)酵法制備聚唾液酸的研究[D];江南大學(xué);2011年

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本文編號(hào)：2806170