【摘要】：環(huán)β-1,2-葡聚糖是以葡萄糖為單體,經(jīng)β-1,2-糖苷鍵連接的聚合度位于17~40之間的具有較強水溶性的環(huán)形多糖。環(huán)β-1,2-葡聚糖在植物根瘤形成、布魯氏菌免疫逃逸等過程中起著重要作用。獲得足量的環(huán)β-1,2-葡聚糖是分析其詳細(xì)功能及作用機制的基礎(chǔ)。但是目前尚沒有大量獲得環(huán)β-1,2-葡聚糖的有效方法與途徑。針對該問題,本文以生物安全菌株放射型根瘤菌(Rhizobium radiobacter ATCC 1333)為研究對象,通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基、條件和發(fā)酵工藝,探索強化環(huán)β-1,2-葡聚糖合成的策略,對發(fā)酵液中的多糖進行分離純化和結(jié)構(gòu)解析,并對NaNO_3強化環(huán)葡聚糖合成與分泌的發(fā)酵工藝與分子機制進行了初探,主要研究如下:(1)優(yōu)化發(fā)酵法合成胞外環(huán)葡聚糖產(chǎn)量,首先對8種氮源和6種碳源進行初選,并對培養(yǎng)基成分進行單因素優(yōu)化;然后設(shè)計Plackett-Burman試驗,篩選出顯著影響胞外環(huán)葡聚糖產(chǎn)量的因素;最后采用四因素五水平的響應(yīng)面優(yōu)化法實現(xiàn)胞外環(huán)葡聚糖產(chǎn)量的最大化。優(yōu)化得到最佳發(fā)酵條件為:甘露醇23.0 g·L~(-1)、谷氨酸3.5 g·L~(-1)、NaCl 0.2 g·L~(-1)、溫度32℃,該條件下胞外環(huán)葡聚糖產(chǎn)量為1.78 g·L~(-1),與優(yōu)化前相比,胞外環(huán)葡聚糖產(chǎn)量提高了206.9%。(2)針對高濃度谷氨酸使發(fā)酵液顏色發(fā)生褐化、造成細(xì)胞濃度無法提高,進而影響環(huán)葡聚糖合成的問題,提出pH調(diào)控策略。在7 L反應(yīng)器的基礎(chǔ)上建立通過調(diào)控pH結(jié)合谷氨酸補料抑制褐變的發(fā)生來提高細(xì)胞濃度的發(fā)酵控制策略。并提出pH兩階段控制策略,生長期將pH控制在7.0,產(chǎn)糖期控制pH為5.5,同時間歇補充氮源,從而成功抑制了發(fā)酵液褐化的現(xiàn)象,并將細(xì)胞濃度提高到6.36 g·L~(-1),環(huán)葡聚糖濃度提高到2.79g·L~(-1);另外結(jié)合溶氧控制策略,進一步將細(xì)胞濃度增加至8.94 g·L~(-1),環(huán)葡聚糖產(chǎn)量達到2.94 g·L~(-1),菌體的生產(chǎn)強度為0.34 g·g~(-1),較優(yōu)化前細(xì)胞濃度提高了138.3%,環(huán)葡聚糖的產(chǎn)量提高了61.5%。(3)確定發(fā)酵液中多糖組分的精細(xì)結(jié)構(gòu)。對經(jīng)pH調(diào)控后的發(fā)酵多糖產(chǎn)物進行提取純化,結(jié)合乙醇分級沉淀、固相萃取法以及高效液相法進行純化制備,利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜、單糖組成分析、電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜、傅里葉紅外光譜和核磁共振手段對發(fā)酵部分多糖進行結(jié)構(gòu)解析,確定這部分多糖主要有兩個組分:組分Ⅰ是酸性多糖,由七個葡萄糖和一個半乳糖組成,含有丙酮酸和琥珀酸取代基;組分Ⅱ是以葡萄糖為單體,通過β-1,2-糖苷鍵連接的環(huán)葡聚糖,聚合度分布為17~22,主要以19個聚合度為主,無支鏈結(jié)構(gòu)。(4)發(fā)現(xiàn)NaNO_3作為氮源有利于環(huán)葡聚糖的胞外分泌,并在此基礎(chǔ)上提出谷氨酸-NaNO_3補料策略,使得環(huán)葡聚糖的胞外分泌量大增。然后利用雙向電泳技術(shù)對兩種氮源發(fā)酵的菌體中胞內(nèi)蛋白進行差異分析,主要差異蛋白涉及無機離子的轉(zhuǎn)運和代謝、胞外多糖合成、能量代謝以及氧化還原等功能,且ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)對環(huán)葡聚糖的合成以及胞外分泌有著至關(guān)重要的作用。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：TQ929
【圖文】：

級沉淀組分的薄層層析驗證以及 MALDI-TOF MS 驗證(a：TLC 驗證圖沉淀 2；b：沉淀 1 的 MALDI-TOF MS 圖；c：沉淀 2 的 MALDI-TOF M6 The verification of fermentation fractionated precipitation components by phy and MALDI-TOF MS ( a is the TLC graph, 1 is precipitate 1, 2 is precipMALDI-TOF MS of precipitated 1; c is the MALDI MS of precipitated 2) 法分離沉淀 2PLC 法對多糖組分沉淀 2 進行檢測分析，分析方法如 2.4.3。主-17a)，并對各個峰收集，進行 TLC 驗證(圖 3-17b)。圖 3-17 HPLC 的譜圖(a)以及各峰組分的 TLC 驗證(b)

級沉淀組分的薄層層析驗證以及 MALDI-TOF MS 驗證(a：TLC 驗證圖沉淀 2；b：沉淀 1 的 MALDI-TOF MS 圖；c：沉淀 2 的 MALDI-TOF M6 The verification of fermentation fractionated precipitation components by phy and MALDI-TOF MS ( a is the TLC graph, 1 is precipitate 1, 2 is precipMALDI-TOF MS of precipitated 1; c is the MALDI MS of precipitated 2) 法分離沉淀 2PLC 法對多糖組分沉淀 2 進行檢測分析，分析方法如 2.4.3。主-17a)，并對各個峰收集，進行 TLC 驗證(圖 3-17b)。

b：沉淀 1 的 MALDI-TOF MS 圖；c：沉淀 2 的 MALDrification of fermentation fractionated precipitation compoMALDI-TOF MS ( a is the TLC graph, 1 is precipitate 1, 2I-TOF MS of precipitated 1; c is the MALDI MS of precip沉淀 2對多糖組分沉淀 2 進行檢測分析，分析方法如 并對各個峰收集，進行 TLC 驗證(圖 3-17b)。圖 3-17 HPLC 的譜圖(a)以及各峰組分的 TLC 驗證(b)17 HPLC chromatograms (a) and TLC verification of each

【參考文獻】

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本文編號：2806170