【摘要】：D-1,2,4-丁三醇(D-1,2,4-butanetriol,BT)是一種非天然生物合成化學(xué)品,應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)及生活中多個領(lǐng)域。目前為止,利用微生物代謝合成BT仍然依賴于外源基因的游離表達(dá),其不穩(wěn)定性對未來的工業(yè)應(yīng)用存在潛在的不利影響,因此,本研究利用分子手段構(gòu)建更穩(wěn)定整合型BT合成菌株,敲除木糖分支代謝途徑、弱化PTS系統(tǒng)、強(qiáng)化表達(dá)戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、阻斷3,4-二羥基丁酸副產(chǎn)物途徑,通過廉價乳糖誘導(dǎo)下共底物發(fā)酵合成BT,為后續(xù)放大研究提供借鑒。為構(gòu)建整合型BT合成菌株并敲除木糖分支代謝途徑,利用Red重組技術(shù)將外源基因kivD、xdh敲入到大腸桿菌木糖分支代謝途徑關(guān)鍵基因xylAB位點(diǎn),kivD、xdh酶活測定及PCR驗(yàn)證表明同時完成了整合與敲除,木糖轉(zhuǎn)化為BT產(chǎn)量達(dá)到0.7 g·L~(-1),木糖轉(zhuǎn)化率為0.12 mol·mol~(-1);為緩解重組菌在單一碳源條件下生長受限,添加5 g·L~(-1)葡萄糖,菌體生物量提高了36%,但木糖代謝速率下降了33%,BT產(chǎn)量僅為0.59 g·L~(-1);為抑制上述CCR效應(yīng),實(shí)現(xiàn)木糖、葡萄糖共底物發(fā)酵,利用同樣技術(shù)將kivD、xdh整合至ptsHI位點(diǎn),對大腸桿菌進(jìn)行增加拷貝數(shù)和PTS系統(tǒng)改造,產(chǎn)量最高可達(dá)2.8 g·L~(-1)。為提高工程菌BT產(chǎn)量,研究強(qiáng)化戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白提高木糖轉(zhuǎn)運(yùn)效率并阻斷3,4-二羥基丁酸副產(chǎn)物代謝途徑,通過過表達(dá)不同的戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因,發(fā)現(xiàn)其中質(zhì)子協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(XylE)的高效表達(dá)更有利于BT的合成,產(chǎn)量提高至4.37 g·L~(-1);重組菌已敲除木糖分支代謝途徑的木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶基因(xylA、xylB)和中間代謝產(chǎn)物2-酮-3-脫氧木糖酸(KDX)旁路代謝途徑中的醛縮酶基因(yagE、yjhH),為進(jìn)一步提高主代謝途徑碳通量,利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)敲除3,4-二羥基丁酸副產(chǎn)物途徑,醛脫氫酶基因feaB缺失有效增強(qiáng)主代謝途徑對碳流的競爭力及木糖的轉(zhuǎn)化效率,使得BT產(chǎn)量提高了37%,進(jìn)一步增加到6.0 g·L~(-1)。為進(jìn)一步提高BT產(chǎn)量和降低成本,優(yōu)化底物糖濃度,并利用乳糖替代IPTG誘導(dǎo)外源基因的表達(dá),結(jié)果表明:增加底物木糖、葡萄糖濃度有利于提高重組菌生物量及BT產(chǎn)量,經(jīng)優(yōu)化后達(dá)到6.8 g·L~(-1);利用無毒且價格低廉的乳糖替代IPTG誘導(dǎo)重組菌合成BT,并對乳糖濃度、誘導(dǎo)時機(jī)、誘導(dǎo)溫度進(jìn)行條件優(yōu)化,BT產(chǎn)量可達(dá)到4.5 g·L~(-1),轉(zhuǎn)化率為0.31 mol·mol~(-1);在5 L發(fā)酵罐中分批發(fā)酵重組菌,恒定的通氣量及高攪拌轉(zhuǎn)速有利于菌體的生長,與搖瓶發(fā)酵相比,生物量提高了38%,BT產(chǎn)量達(dá)到5.9 g·L~(-1)。本論文產(chǎn)BT重組菌穩(wěn)定性問題的解決及整合型工程菌共底物發(fā)酵等研究,為后續(xù)放大研究打下基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TQ923;Q78
【圖文】：

圖 1-1 BT 化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1-1 Molecular Stucture of BT要的藥物合成中間體，它可以用于合成；且可降低香煙中的有害物質(zhì)的含量，物1,2,4-丁三醇三硝酸酯(1,2,4-butaneE)的重要增塑劑，可與硝化甘油混合，以設(shè)備的推進(jìn)劑，如導(dǎo)彈、飛機(jī)等[5-7]，逐步替代硝化甘油成為更安全、有效合成靠化學(xué)合成法，作為重要的化工產(chǎn)品之ner 首次以 3-丁烯醇為原料通過水合法提取方面優(yōu)化生產(chǎn)，并取得了顯著的[8-10]。目前工業(yè)合成BT 的方法主要有 被 H2O2氧化后經(jīng)高壓氫化[12]；丙烯

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文2003 年，研究人員首次以霉實(shí)假單胞菌(Pseudomonas fragi)為宿主，利用菌體自身脫氫酶催化反應(yīng)合成阿拉伯糖酸及木糖酸，最終反應(yīng)得率為 70%，后期通過基因工程手段在大腸桿菌中異源表達(dá)苯甲酰甲酸脫羧酶得到木糖酸，其篩選自惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)，再經(jīng)過脫水、脫羧、還原三步反應(yīng)轉(zhuǎn)化為 BT，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到17.5%[15]。后期研究主要集中在以價格低廉的底物代替木糖生產(chǎn) BT，2009 年，F(xiàn)rost 在大腸桿菌中表達(dá)磷酸酶基因(yfbT)及木糖脫氫酶基因(xdh)，并敲除副產(chǎn)物途徑，重組菌可以廉價的葡萄糖為底物合成木糖酸，再經(jīng)三步反應(yīng)轉(zhuǎn)化為 BT，使得合成產(chǎn)品的成本降低[17]。同年，Li[18]等在 E. coli BL21(DE3)中以葡萄糖為唯一底物構(gòu)建了 BT 合成的代謝路徑，首先葡萄糖經(jīng)糖酵解和 TCA 循環(huán)途徑得到蘋果酸，再經(jīng)過六步酶促反應(yīng)實(shí)現(xiàn)蘋果酸到 BT 的轉(zhuǎn)化，其中包括 4-羥基丁酸脫氫酶、蘋果酸硫激酶、4-羥基丁酸 CoA-轉(zhuǎn)移酶、琥珀酸-半醛脫氫酶及醛/醇脫氫酶，相關(guān)酶基因都融合到質(zhì)粒中誘導(dǎo)表達(dá)，BT 最終產(chǎn)量達(dá)到 120 ng·L-1。

粒的菌株進(jìn)入大自然中也會造成環(huán)境污染。木糖轉(zhuǎn)運(yùn)效率有限且菌體生還未解決。因整合表達(dá)及其應(yīng)用著生命科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用生物法替代化學(xué)合成的方法生產(chǎn)化工產(chǎn)品展的大趨勢，目前研究，構(gòu)建的化學(xué)品合成菌株多都含有載體和誘導(dǎo)味著發(fā)酵過程中要添加抗生素和誘導(dǎo)劑，并且質(zhì)粒在發(fā)酵和傳代過程中大量復(fù)制加重了菌體的生長負(fù)擔(dān)，其不穩(wěn)定性及對菌體的危害限制了其建基因整合菌是為了構(gòu)建出無誘導(dǎo)物和無質(zhì)粒的菌株，優(yōu)勢在于在發(fā)酵導(dǎo)、基因的連續(xù)表達(dá)以及降低生產(chǎn)成本等[26]。天然的組成型啟動子已廣酵母中的靶基因表達(dá)來生產(chǎn)生物基化學(xué)品[27,28]和天然產(chǎn)物[29]。而在大腸 系列表達(dá)載體，其需要抗性標(biāo)記篩選并且 IPTG 誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)生長造成巨大負(fù)擔(dān)，連續(xù)傳代過程中容易丟失造成發(fā)酵后期產(chǎn)率下降得攜帶抗性的菌體流入大自然也不利于綠色環(huán)保，利用 Red 重組技術(shù)將基因組中更適宜宿主細(xì)胞生長且避免上述弊端，整合機(jī)制如圖 1-3。

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4 林oび

本文編號：2800365