【摘要】：細(xì)胞膜表面的糖作為細(xì)胞的最外層,是一類(lèi)被細(xì)胞外環(huán)境最先識(shí)別的分子,因此細(xì)胞膜表面糖類(lèi)參與了眾多重要的生物過(guò)程,比如細(xì)胞分化、免疫反應(yīng)、疾病進(jìn)展及細(xì)胞的凋亡等。然而天然糖類(lèi)結(jié)構(gòu)的多變、異質(zhì)和復(fù)雜性,限制了研究者們探索糖分子的結(jié)構(gòu)和種類(lèi)對(duì)特定細(xì)胞功能的影響,因此通過(guò)化學(xué)合成的手段制備結(jié)構(gòu)規(guī)整可控的糖聚物并結(jié)合細(xì)胞膜表面改性方案將其修飾到細(xì)胞膜表面,有助于研究具有特定結(jié)構(gòu)的糖聚物對(duì)細(xì)胞間的信號(hào)交流以及細(xì)胞功能的影響,為細(xì)胞膜表面工程的發(fā)展提供方法論指導(dǎo)及應(yīng)用基礎(chǔ)。基于以上思路,本論文圍繞“合成糖聚物對(duì)細(xì)胞膜的改性及對(duì)細(xì)胞功能的調(diào)控研究”這一主題展開(kāi)了系列研究工作。鑒于細(xì)胞膜表面糖類(lèi)在調(diào)控胚胎干細(xì)胞(ESCs)分化行為和免疫反應(yīng)這兩個(gè)過(guò)程中的重要性,本論文利用合成糖聚物修飾到細(xì)胞膜表面實(shí)現(xiàn)對(duì)上述兩種過(guò)程中細(xì)胞功能的調(diào)控。首先通過(guò)可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)聚合與聚合后修飾(PPM)相結(jié)合,制備了新型的磷脂化糖胺聚糖類(lèi)似物,系統(tǒng)研究了其對(duì)不同種類(lèi)細(xì)胞膜表面的修飾,以及對(duì)小鼠ESCs(mESCs)神經(jīng)分化行為的影響和對(duì)特定信號(hào)通路的調(diào)控作用,為細(xì)胞膜表面糖類(lèi)和受體參與的ESCs其他分化行為的研究提供了新的途徑和思路。鑒于磷脂化糖聚物在細(xì)胞膜表面的停留半衰期通常為幾個(gè)小時(shí),在后續(xù)的研究中我們進(jìn)一步發(fā)展了一種基于膜結(jié)合HaloTag蛋白(HTP)平臺(tái)在細(xì)胞膜表面穩(wěn)定修飾外源糖聚物的方案,擬研究發(fā)生在較長(zhǎng)時(shí)間尺度上的生物過(guò)程,例如免疫調(diào)控過(guò)程。我們結(jié)合了重組蛋白技術(shù)與RAFT聚合方法在細(xì)胞膜表面穩(wěn)定修飾系列特定結(jié)構(gòu)糖聚物,研究了不同種類(lèi)的合成糖聚物修飾癌細(xì)胞后對(duì)巨噬細(xì)胞極化及樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的影響,突出了癌細(xì)胞膜表面特定結(jié)構(gòu)糖聚物在調(diào)控免疫細(xì)胞活性過(guò)程中的重要性,有望實(shí)現(xiàn)糖聚物改性的癌細(xì)胞在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用。主要研究?jī)?nèi)容如下:(一)新型磷脂化糖胺聚糖類(lèi)似物的合成及其對(duì)細(xì)胞膜表面的修飾。首先采用RAFT聚合方法,將4-乙烯基苯磺酸鈉(SS)、N-甲基丙烯酰葡糖胺(MAG)和甲基丙烯酰氧基熒光素(FluMA)進(jìn)行聚合,制備了一系列綠色熒光素標(biāo)記的糖胺聚糖類(lèi)似物(pSMF),進(jìn)一步將聚合物末端還原成巰基后與合成的馬來(lái)酰亞胺化的磷脂分子(MAL-DPPE)發(fā)生點(diǎn)擊反應(yīng),從而將磷脂分子接枝到糖胺聚糖類(lèi)似物主鏈上。通過(guò)核磁氫譜、紅外以及聚合物溶液巰基密度的測(cè)定驗(yàn)證了磷脂化糖胺聚糖類(lèi)似物(DPPE-pSMF)的成功合成。激光共聚焦顯微鏡熒光照片及單個(gè)細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度分布證明了 DPPE-pSMF成功結(jié)合到模型細(xì)胞HeLa的表面,而不帶磷脂基團(tuán)的pSMF則被HeLa細(xì)胞內(nèi)吞;流式細(xì)胞儀結(jié)果證明了 DPPE-pSMF 結(jié)合到 HeLa 細(xì)胞膜表面的量有一定的聚合物濃度依賴(lài)性;并且結(jié)合到細(xì)胞膜表面的糖胺聚糖類(lèi)似物具有促進(jìn)L929細(xì)胞增殖的效果。(二)磷脂化糖胺聚糖類(lèi)似物對(duì)mESCs細(xì)胞膜表面的修飾及其對(duì)mESCs神經(jīng)分化的影響。倒置熒光顯微鏡圖片證明了 DPPE-pSMF孵育mESCs細(xì)胞1小時(shí)后能成功修飾到mESCs表面上。用不同糖聚物誘導(dǎo)神經(jīng)分化14天后的結(jié)果顯示:DPPE-pSMF孵育細(xì)胞的β3-tubulin(神經(jīng)元特異性表達(dá)marker)表達(dá)量分別達(dá)到pSMF和天然肝素孵育的細(xì)胞表達(dá)量的～1.9倍和～3.8倍,并且在相同的分化周期下,與pSMF和天然肝素孵育的細(xì)胞相比,DPPE-pSMF孵育的細(xì)胞分化的神經(jīng)細(xì)胞更多。我們進(jìn)一步探索了 DPPE-pSMF促進(jìn)mESCs高效分化成神經(jīng)細(xì)胞的機(jī)制,結(jié)果顯示修飾到mESCs細(xì)胞膜表面的合成糖胺聚糖類(lèi)似物可以增強(qiáng)成纖維生長(zhǎng)因子2(FGF2)與細(xì)胞膜表面的結(jié)合,并增強(qiáng)了細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)的磷酸化,表明DPPE-pSMF修飾mESCs膜后增強(qiáng)了對(duì)FGF2-ERK1/2信號(hào)通路的激活。上述結(jié)果揭示了我們合成的特定結(jié)構(gòu)糖胺聚糖類(lèi)似物引入到mESCs能夠促進(jìn)其神經(jīng)分化的高效性,且該細(xì)胞膜表面修飾糖聚物的方案也可以用于調(diào)控細(xì)胞膜表面受體介導(dǎo)的其他細(xì)胞功能。(三)基于HTP的蛋白融合技術(shù)與RAFT聚合相結(jié)合在細(xì)胞膜表面穩(wěn)定修飾合成糖聚物。首先通過(guò)基因轉(zhuǎn)染將合成的HTP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)HeLa細(xì)胞,篩選21天后得到細(xì)胞膜表面穩(wěn)定表達(dá)HTP的HeLa細(xì)胞系(HTP-HeLa);進(jìn)一步通過(guò)化學(xué)合成的手段制備了一種新型的氯代烷烴修飾的鏈轉(zhuǎn)移劑(CPADB-C1),利用該合成的鏈轉(zhuǎn)移劑進(jìn)行了 MAG和生物素單體的RAFT聚合,得到氯代烷烴修飾的生物素標(biāo)記的葡萄糖聚合物pMB。通過(guò)核磁及體積排除色譜(SEC)驗(yàn)證了pMB的成功制備。激光共聚焦熒光圖片結(jié)果證明了 pMB于37oC下孵育HTP-HeLa 1 h可以成功修飾到細(xì)胞膜表面,并且其在細(xì)胞膜表面的停留時(shí)間長(zhǎng)達(dá)7天,證明通過(guò)細(xì)胞膜表面結(jié)合的HTP在細(xì)胞膜表面引入外源糖聚物方案的穩(wěn)定性。(四)不同結(jié)構(gòu)合成糖聚物修飾的癌細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞極化及樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的影響。循環(huán)腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)可以“自我歸巢”到初生腫瘤或轉(zhuǎn)移性腫瘤部位的特性表明腫瘤細(xì)胞可以作為攜帶治療性試劑的載體。基于此,我們提出利用糖聚物改性的癌細(xì)胞來(lái)原位刺激腫瘤部位的免疫細(xì)胞,從而誘導(dǎo)抗癌活性的概念。首先驗(yàn)證了合成糖聚物修飾的癌細(xì)胞在體外刺激巨噬細(xì)胞極化和樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的效果。以合成的CPADB-C1為鏈轉(zhuǎn)移劑,分別進(jìn)行了 MAG和N-甲基丙烯酰甘露糖胺(MAM)的RAFT聚合,得到氯代烷烴修飾的兩種結(jié)構(gòu)規(guī)整的糖聚物pMAG和pMAM,核磁和SEC驗(yàn)證了 pMAG和pMAM的成功制備。將合成的兩種糖聚物修飾到HTP-HeLa表面分別得到pMAG-HeLa和pMAM-HeLa,結(jié)果表明pMAG-HeLa和pMAM-HeLa都具有促進(jìn)U937向M1型極化的效果,糖聚物改性的癌細(xì)胞顯著提高了 M1型巨噬細(xì)胞表面抗原CD86的表達(dá),并且上調(diào)了促炎因子 IL-12p70、TNF-α和iNOS分泌水平;同時(shí)糖聚物改性的癌細(xì)胞還具有促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的效果,且其在小鼠體內(nèi)皮下注射時(shí)幾乎沒(méi)有致瘤性。這些結(jié)果展現(xiàn)了糖聚物改性的癌細(xì)胞在癌癥免疫治療中的應(yīng)用前景。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R730.51;TQ317
【圖文】：

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本文編號(hào)：2795883