發(fā)布時間：2020-08-01 16:41

【摘要】：可再生半纖維素的主要成分木聚糖降解為單體木糖的過程需要一系列酶的共同參與。該多糖的基本骨架為β-1,4糖苷鍵相連的D-吡喃木糖,并且含有以下側(cè)鏈取代基,如乙�；�、阿拉伯糖和葡萄糖醛酸。木聚糖的完全降解需要完整的木聚糖水解酶系,主要包括β-1,4-木聚糖酶和β-木糖苷酶。本實驗中所使用的黑曲霉(Aspergillus niger)可以產(chǎn)β-木糖苷酶和木聚糖酶,其中β-木糖苷酶水解可溶性低聚木糖和木二糖的非還原末端釋放木糖。本研究首先對實驗室保藏的一株黑曲霉產(chǎn)木糖苷酶的發(fā)酵條件和發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。通過單因素優(yōu)化實驗確定了該菌產(chǎn)木糖苷酶的最優(yōu)發(fā)酵條件。通過Plackett-Burman設(shè)計試驗、Central Composite Design中心復(fù)合試驗等方法確定了該菌株產(chǎn)木糖苷酶的最適發(fā)酵培養(yǎng)基組分。然后對該菌株進(jìn)行紫外誘變篩選出一株高產(chǎn)木糖苷酶的菌株,并對其進(jìn)行二次優(yōu)化。最后對分離純化后的木糖苷酶進(jìn)行了表征,同時研究了該酶與木聚糖酶協(xié)同作用,主要研究結(jié)果如下。(1)確定實驗室保藏菌株黑曲霉(Aspergillus niger)為出發(fā)菌株。通過測定細(xì)胞干重的方法測得該菌株的生長曲線,選取36h為種子培養(yǎng)時間。采用單因素實驗、Plackett-Burman設(shè)計實驗、Central Composite Design設(shè)計實驗等方法確定了該菌株產(chǎn)木糖苷酶的最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵時間144h,發(fā)酵溫度34℃,接種量7%,搖瓶轉(zhuǎn)速為180 r/min,裝液量110 m L/300m L,初始發(fā)酵p H為3.5。最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成為玉米芯粉31.55 g/L,酵母粉8.00 g/L,蛋白胨5.48 g/L,硫酸鎂0.70 g/L,氯化鈉1.00 g/L,氯化鈣1.50 g/L。預(yù)測酶活為15.04 U/m L實測酶活為14.87 U/m L,結(jié)果相近,說明上述優(yōu)化方法得到的實驗結(jié)果是合理可信的。優(yōu)化發(fā)酵條件和培養(yǎng)基組成后,木糖苷酶酶活是優(yōu)化前的8.89倍。(2)對原始菌株CAN進(jìn)行紫外誘變,紫外照射最佳時間為1.5 min,獲得紫外誘變突變株CANT,經(jīng)搖瓶發(fā)酵測定酶活為25.12 U/m L,比CAN提高了69%左右,并且具有良好的遺傳穩(wěn)定性。測定其生長曲線,選取40 h為種子培養(yǎng)時間。(3)采用單因素實驗、Plackett-Burman設(shè)計實驗、Central Composite Design設(shè)計實驗等方法方法得到該菌株產(chǎn)木糖苷酶的最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵時間156 h,發(fā)酵溫度34℃,接種量5%,搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min,裝液量110 m L/300m L,初始發(fā)酵p H為4.0。最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成為玉米芯粉40.00 g/L,酵母粉5.00 g/L,蛋白胨22.41 g/L,磷酸二氫鉀0.50 g/L,磷酸氫二鉀0.50 g/L,硫酸鎂0.50 g/L,氯化鈉1.00 g/L,氯化鈣1.50 g/L。預(yù)測酶活為47.02 U/m L實測酶活為46.77 U/m L,結(jié)果相差不大,說明采用上述一系列優(yōu)化方法得到的實驗結(jié)果是合理可靠的。優(yōu)化發(fā)酵條件和培養(yǎng)基組成后,木糖苷酶酶活是優(yōu)化前的1.86倍,是出發(fā)菌株CAN的27.97倍。(4)通過一步鹽析和三步層析等分離純化步驟,,最終得到純化倍數(shù)33.68,比酶活1954.23 U/mg的高純度酶蛋白,SDS-PAGE測得分子量約為121.0 KDa。對電泳純的木糖苷酶進(jìn)行表征,該木糖苷酶最適反應(yīng)溫度為70℃,在30℃~60℃范圍下4 h后相對殘留酶活仍有75%;最適反應(yīng)p H為4.0,在p H 4~p H 10范圍下4 h后相對殘留酶活仍有70%。研究了木糖苷酶和木聚糖酶一起降解玉米芯粉的協(xié)同作用,兩種酶一起降解玉米芯粉得到還原糖的量是單木聚糖酶降解產(chǎn)生還原糖量的347.1%。對兩種酶降解玉米芯粉的產(chǎn)物進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)單一木聚糖降解玉米芯粉的主要產(chǎn)物為木糖、木二糖、木三糖、木四糖等低聚木糖,兩種酶一起降解玉米芯粉的主要產(chǎn)物對比單一木聚糖酶的降解產(chǎn)物中木糖含量明顯增加,木二糖、木三糖、木四糖等低聚木糖的含量減少。
【學(xué)位授予單位】：湖北工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TQ925
【圖文】：

吡喃木糖基骨架組成，并且可以被不同的側(cè)基取代，木聚糖來源的不同將導(dǎo)致聚糖側(cè)鏈的數(shù)量和組成有些許差異。在纖維素后，半纖維素（主要組成成分為木聚糖）被認(rèn)為是植物中第二豐的多糖。它是復(fù)雜的支鏈雜聚物，它們可以由戊糖（木糖和阿拉伯糖），己糖（露糖，葡萄糖和半乳糖）和糖醛酸（β-D-葡萄糖醛酸，α-D-α-甲基葡萄糖醛酸和 α半乳糖醛酸）組成[2-3]。木糖苷酶通過與不同酶的協(xié)同作用將它們水解成各自的糖組分。這種酶系統(tǒng)被稱為木聚糖水解復(fù)合物，主要包括作用于多糖主鏈β-1,4-D-木聚糖酶和 β-木糖苷酶[4]。木聚糖酶和 β-木糖苷酶一起水解木聚糖寡糖從而釋放木糖分子。復(fù)合物中的其它降解酶負(fù)責(zé)消除其特定的取代基，包括 α-L-阿拉伯呋喃糖酶（EC 3.2.1.55），乙酰木聚糖酯酶（EC 3.1.1.72），α-D-半乳糖苷酶（EC 3.2.1α-D-葡萄糖醛酸酶（EC 3.2.1.139），阿魏酸酯酶（EC 3.1.1.73）和（反式對羥丙烯酸酯酶）對香豆酸酯酶（EC 3.1.1）[5-6]。這些酶被稱為輔助酶或解聚酶，并木聚糖水解過程中與木聚糖酶和 β-木糖苷酶組合起作用。這些輔助酶能夠作用骨架殘基和取代基之間的鍵或取代基與取代基之間的鍵[7]，如圖 1.1。

ett-Burman 設(shè)計試驗篩選出的顯著性因素為基礎(chǔ)，為了進(jìn)一，通過最陡爬坡試驗然確定這些顯著因素的最佳區(qū)域。依，設(shè)計合理的步長，增加實驗的密集度，來逼近效果最好.2.3 優(yōu)化后的實驗條件。tral Composite Design 設(shè)計試驗（CCD 試驗）化設(shè)計試驗通過合理地選取試驗點和迭代策略, 克服了傳物培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分選擇的優(yōu)化中均取得了顯著的成果，運用 Design-Expert 軟件，對實驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，析圖，并預(yù)測最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成。發(fā)酵條件為 2.2.3 優(yōu)化與分析基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

0.000.010.020.030 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64體菌重（干時間（h）圖 2.2 CAN 的生長曲線Figure2.2 The growth curve of Streptomyces althioticus CANN 的生長曲線如圖 2.2 所示，20~48 h 此為菌株對數(shù)生長期，h 作為種子轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基。 CAN 產(chǎn)木糖苷酶發(fā)酵條件的優(yōu)化周期對 CAN 產(chǎn)木糖苷酶的影響 可知，發(fā)酵前期菌株利用營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長繁殖。，酶活隨升高，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到 144 h 時酶活達(dá)到最高，為 1.672 U/mL，隨著發(fā)酵培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和有毒物質(zhì)的積累導(dǎo)降，故選擇發(fā)酵周期為 144 h。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王嵐;江正強;楊紹青;;嗜熱擬青霉產(chǎn)胞外木糖苷酶發(fā)酵條件的優(yōu)化[J];微生物學(xué)通報;2007年03期

本文編號：2777725