【摘要】：高F值寡肽是一類富含支鏈氨基酸的小肽混合物,它具有多種生理活性包含保肝護(hù)肝、治療苯丙酮尿癥、抗疲勞等,是目前活性肽領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。本研究以活性干酵母為制備高F值寡肽初始原料,利用超聲破碎酵母細(xì)胞壁并對(duì)破碎工藝進(jìn)行優(yōu)化,獲得破碎優(yōu)化條件:超聲功率400 W、時(shí)間20 min。從四種常用內(nèi)切酶中篩選出堿性蛋白酶作為最適酵母抽提酶來(lái)獲取酵母蛋白,單因素優(yōu)化堿性蛋白酶抽提酵母細(xì)胞的最適條件為料液比1:6、溫度50℃、加酶量1000 U·g~(-1)、pH 8.0、酶解時(shí)間6 h。采用納濾濃縮酵母抽提液并去除游離氨基酸獲得酵母粗肽,優(yōu)化獲得操作條件:500Da納濾膜、0.3 MPa、濃縮3倍。利用α-胰凝乳蛋白酶和羧肽酶A雙酶依次定向酶解酵母粗肽使芳香族氨基酸從酵母粗肽內(nèi)游離出來(lái)。對(duì)這兩種酶進(jìn)行單因素和正交優(yōu)選實(shí)驗(yàn),獲得α-胰凝乳蛋白酶最佳酶解條件:加酶量8000 U·g~(-1)酵母粗肽、溫度40℃、pH 8.0、時(shí)間5 h;羧肽酶A最佳酶解條件:加酶量4 U·mL~(-1)、溫度40℃、酶解pH 8.0、時(shí)間4 h。采用活性炭吸附,將游離的芳香族氨基酸去除以獲得高F值寡肽。通過(guò)單因素優(yōu)化獲得最佳吸附條件:吸附時(shí)間2 h,吸附溫度30℃,吸附pH 2.5,吸附炭液比1:10。在此集成工藝下成功獲得了數(shù)批F值在30-40之間的高F值酵母寡肽,整個(gè)過(guò)程多肽得率為14.1%,寡肽分子量1000 Da以下占比95%。為降低高F值寡肽生產(chǎn)成本,利用溶劑熱法制備得到一種具有立體結(jié)構(gòu)的復(fù)合磁性納米粒子。通過(guò)掃描電鏡、透射電鏡、比表面分析儀、X射線衍射儀、傅里葉紅外光譜儀、Zeta電位儀等進(jìn)行性質(zhì)表征,結(jié)果表明制備獲得的磁性納米顆粒平均粒徑為12 nm,具有Fe_3O_4尖晶石結(jié)構(gòu)而比表面積為78.9377 m2·g~(-1)且富含不同官能團(tuán)。利用制備的磁性納米顆粒固定α-胰凝乳蛋白酶,發(fā)現(xiàn)制備的固定化酶可重復(fù)利用性好且具有比游離酶更好的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。固定化α-胰凝乳蛋白酶循環(huán)使用8次(40℃、pH 8.0),酶活剩余率為65%。室溫保存30天,固定化α-胰凝乳蛋白酶酶活剩余率為60%。以制備的磁性納米顆粒為核心先固定α-胰凝乳蛋白酶再結(jié)合包埋法利用混合羧肽酶A的海藻酸鈉包被磁性納米顆粒形成雙酶共固定的磁性凝膠顆粒,對(duì)于包埋條件進(jìn)行了單因素優(yōu)化,確定海藻酸鈉濃度2.5%(w/v)、CaCl_2溶液濃度5%(w/v)、羧肽酶A加酶量500 U、固定時(shí)間2 h。通過(guò)熒光標(biāo)記確認(rèn)雙酶均勻結(jié)合到了磁性凝膠顆粒上。利用制備的固定化酶酶解酵母粗肽,發(fā)現(xiàn)酶解5次后酶活剩余率為30%。通過(guò)對(duì)制備高F值寡肽的兩種酶進(jìn)行固定化并應(yīng)用于實(shí)際酶解,發(fā)現(xiàn)雙酶經(jīng)固定化雖然酶解效率有所降低但是可實(shí)現(xiàn)重復(fù)使用,可見(jiàn)雙酶共固定化具有一定的應(yīng)用前景。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TQ464.7

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本文編號(hào)：2764838