【摘要】：脂肪酶在非水相中催化的酯化反應(yīng)具有重要的工業(yè)應(yīng)用。天然脂肪酶的非水相酯合成活性普遍較低,研究如何提高脂肪酶的非水相催化活性具有重要的理論和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。來(lái)源于絲狀真菌華根霉的脂肪酶具有較高的酯合成活性,但是異源表達(dá)的華根霉脂肪酶未表現(xiàn)出酯合成活性。本研究以異源表達(dá)的華根霉前導(dǎo)肽脂肪酶(r27RCL)和成熟肽脂肪酶(mRCL)為研究對(duì)象,分別通過(guò)不同方法對(duì)酶蛋白進(jìn)行處理,提高重組脂肪酶的酯合成活性,為工業(yè)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果包括:(1)針對(duì)異源表達(dá)的商品化華根霉前導(dǎo)肽脂肪酶r27RCL,研究表面活性劑等處理?xiàng)l件對(duì)脂肪酶酯合成活性的激活效果,提高r27RCL的催化活性。結(jié)果表明,不同表面活性劑對(duì)脂肪酶的作用效果明顯不同,其中n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷(DDM)可有效提高r27RCL酯合成活性。DDM對(duì)r27RCL的激活效果取決于二者的摩爾比,而非單純的表面活性劑濃度。當(dāng)DDM與r27RCL的摩爾比值大于30后,隨著DDM添加量增加,r27RCL的酯合成活性不斷提高。pH和無(wú)機(jī)鹽會(huì)對(duì)DDM對(duì)r27RCL的激活效果有一定的影響。其中,改變磷酸鹽濃度可以強(qiáng)化DDM對(duì)r27RCL酯合成活性的激活效果,最適條件下比活力進(jìn)一步提高96%。(2)針對(duì)由E.coli表達(dá)的華根霉成熟肽脂肪酶mRCL包涵體蛋白,研究變性、復(fù)性以及添加表面活性劑對(duì)脂肪酶酯合成活性的影響。由于mRCL在E.coli中表達(dá)主要形成包涵體,在表達(dá)條件優(yōu)化,提高mRCL包涵體表達(dá)水平的基礎(chǔ)上,進(jìn)行蛋白變性、復(fù)性處理。在初始蛋白濃度100μg·mL~(-1),復(fù)性溫度4℃,pH 8.0條件下,結(jié)合梯度降低尿素濃度進(jìn)行透析復(fù)性,可溶性蛋白回收率可達(dá)72%,但復(fù)性得到的mRCL并不表現(xiàn)出明顯的酯合成活性。在復(fù)性過(guò)程中添加表面活性劑DDM可以將mRCL酯合成活性提高32倍。(3)將酯合成活性得到顯著提高的脂肪酶應(yīng)用于其它非水相催化反應(yīng)。DDM和無(wú)機(jī)鹽激活的r27RCL在有機(jī)溶劑和無(wú)溶劑體系中分別催化生物香料己酸乙酯和生物柴油油酸乙酯的合成,初始反應(yīng)速率和轉(zhuǎn)化率均得到顯著提高,該結(jié)果驗(yàn)證了該酶制劑在催化非水相酯合成反應(yīng)中的有效性和適用性。
【圖文】：

第一章 緒論酶非水相催化酶和非水相催化概述（lipase，EC3.1.1.3）是一類(lèi)酯鍵水解酶，在生物體內(nèi)催化甘油三酰基酯的應(yīng)的脂肪酸、甘油單酯或雙酯和甘油。脂肪酶廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生肪酶易于放大生產(chǎn)和純化，所以是工業(yè)酶制劑的主要來(lái)源。一般而言，脂肪溶性較差，當(dāng)水相中的底物分子足夠多時(shí)會(huì)聚集形成一個(gè)相，脂肪酶位于底上催化酯鍵斷裂。當(dāng)油-水界面出現(xiàn)后，脂肪酶的催化速率會(huì)顯著提高，該活”，是脂肪酶的獨(dú)特性質(zhì)[1, 2]。脂肪酶催化的水解反應(yīng)在洗滌劑添加劑、油制品的增香和風(fēng)味強(qiáng)化、紙制品的脫墨以及絹紡、皮毛、皮革的脫脂等方面[3]。

但未表現(xiàn)出酯合成活性。孫舒揚(yáng)[67]在分離純化華根霉固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的酯酶的研究中發(fā)現(xiàn)，兩種發(fā)酵過(guò)程均產(chǎn)生與細(xì)胞膜結(jié)合并具有高酯合成活性脂肪酶（型華根霉脂肪酶），此外同時(shí)產(chǎn)生多種酯合成活性較低的同功酶。通過(guò)野生型華根霉菌株生產(chǎn)酯合成脂肪酶在工業(yè)應(yīng)用上存在兩個(gè)問(wèn)題。首先是絲狀量難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要，常規(guī)育種方法和發(fā)酵條件優(yōu)化難以顯著提升；其次肪酶同工酶的存在，分離目標(biāo)脂肪酶非常困難。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)物脂肪酶通過(guò)基因工程的方法得到異源表達(dá)，為工業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)[68-71]。2 華根霉脂肪酶基因的克隆及異源表達(dá)Yu 等[72]以華根霉基因組為模板通過(guò) PCR 技術(shù)擴(kuò)增得到了開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng) 1170 bp 華酶全基因序列，為華根霉脂肪酶的異源表達(dá)和分子改造的研究奠定基礎(chǔ)。與其它已霉脂肪酶基因序列比對(duì)，對(duì)華根霉脂肪酶全基因序列的分析結(jié)果表明華根霉脂肪酶由基酸組成，其中包含 26 個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列，，94 個(gè)氨基酸的前導(dǎo)肽序列和 269 個(gè)的成熟肽序列[72, 73]。該基因編碼的成熟肽脂肪酶的 N 端序列與野生型華根霉脂肪酶列分析結(jié)果一致[67, 72, 74]，由此可知野生型華根霉脂肪酶由脂肪酶成熟肽基因編碼。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：TQ925.6

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本文編號(hào)：2709455