【摘要】：脂肪酶在非水相中催化的酯化反應(yīng)具有重要的工業(yè)應(yīng)用。天然脂肪酶的非水相酯合成活性普遍較低,研究如何提高脂肪酶的非水相催化活性具有重要的理論和實際應(yīng)用價值。來源于絲狀真菌華根霉的脂肪酶具有較高的酯合成活性,但是異源表達的華根霉脂肪酶未表現(xiàn)出酯合成活性。本研究以異源表達的華根霉前導肽脂肪酶(r27RCL)和成熟肽脂肪酶(mRCL)為研究對象,分別通過不同方法對酶蛋白進行處理,提高重組脂肪酶的酯合成活性,為工業(yè)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容和結(jié)果包括:(1)針對異源表達的商品化華根霉前導肽脂肪酶r27RCL,研究表面活性劑等處理條件對脂肪酶酯合成活性的激活效果,提高r27RCL的催化活性。結(jié)果表明,不同表面活性劑對脂肪酶的作用效果明顯不同,其中n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷(DDM)可有效提高r27RCL酯合成活性。DDM對r27RCL的激活效果取決于二者的摩爾比,而非單純的表面活性劑濃度。當DDM與r27RCL的摩爾比值大于30后,隨著DDM添加量增加,r27RCL的酯合成活性不斷提高。pH和無機鹽會對DDM對r27RCL的激活效果有一定的影響。其中,改變磷酸鹽濃度可以強化DDM對r27RCL酯合成活性的激活效果,最適條件下比活力進一步提高96%。(2)針對由E.coli表達的華根霉成熟肽脂肪酶mRCL包涵體蛋白,研究變性、復性以及添加表面活性劑對脂肪酶酯合成活性的影響。由于mRCL在E.coli中表達主要形成包涵體,在表達條件優(yōu)化,提高mRCL包涵體表達水平的基礎(chǔ)上,進行蛋白變性、復性處理。在初始蛋白濃度100μg·mL~(-1),復性溫度4℃,pH 8.0條件下,結(jié)合梯度降低尿素濃度進行透析復性,可溶性蛋白回收率可達72%,但復性得到的mRCL并不表現(xiàn)出明顯的酯合成活性。在復性過程中添加表面活性劑DDM可以將mRCL酯合成活性提高32倍。(3)將酯合成活性得到顯著提高的脂肪酶應(yīng)用于其它非水相催化反應(yīng)。DDM和無機鹽激活的r27RCL在有機溶劑和無溶劑體系中分別催化生物香料己酸乙酯和生物柴油油酸乙酯的合成,初始反應(yīng)速率和轉(zhuǎn)化率均得到顯著提高,該結(jié)果驗證了該酶制劑在催化非水相酯合成反應(yīng)中的有效性和適用性。
【圖文】：

第一章 緒論酶非水相催化酶和非水相催化概述（lipase，EC3.1.1.3）是一類酯鍵水解酶，在生物體內(nèi)催化甘油三�；サ膽�(yīng)的脂肪酸、甘油單酯或雙酯和甘油。脂肪酶廣泛存在于動物、植物和微生肪酶易于放大生產(chǎn)和純化，所以是工業(yè)酶制劑的主要來源。一般而言，脂肪溶性較差，當水相中的底物分子足夠多時會聚集形成一個相，脂肪酶位于底上催化酯鍵斷裂。當油-水界面出現(xiàn)后，脂肪酶的催化速率會顯著提高，該活”，是脂肪酶的獨特性質(zhì)[1, 2]。脂肪酶催化的水解反應(yīng)在洗滌劑添加劑、油制品的增香和風味強化、紙制品的脫墨以及絹紡、皮毛、皮革的脫脂等方面[3]。

但未表現(xiàn)出酯合成活性。孫舒揚[67]在分離純化華根霉固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的酯酶的研究中發(fā)現(xiàn)，兩種發(fā)酵過程均產(chǎn)生與細胞膜結(jié)合并具有高酯合成活性脂肪酶（型華根霉脂肪酶），此外同時產(chǎn)生多種酯合成活性較低的同功酶。通過野生型華根霉菌株生產(chǎn)酯合成脂肪酶在工業(yè)應(yīng)用上存在兩個問題。首先是絲狀量難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要，常規(guī)育種方法和發(fā)酵條件優(yōu)化難以顯著提升；其次肪酶同工酶的存在，分離目標脂肪酶非常困難。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，越來物脂肪酶通過基因工程的方法得到異源表達，為工業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)[68-71]。2 華根霉脂肪酶基因的克隆及異源表達Yu 等[72]以華根霉基因組為模板通過 PCR 技術(shù)擴增得到了開放閱讀框全長 1170 bp 華酶全基因序列，為華根霉脂肪酶的異源表達和分子改造的研究奠定基礎(chǔ)。與其它已霉脂肪酶基因序列比對，對華根霉脂肪酶全基因序列的分析結(jié)果表明華根霉脂肪酶由基酸組成，其中包含 26 個氨基酸的信號肽序列，，94 個氨基酸的前導肽序列和 269 個的成熟肽序列[72, 73]。該基因編碼的成熟肽脂肪酶的 N 端序列與野生型華根霉脂肪酶列分析結(jié)果一致[67, 72, 74]，由此可知野生型華根霉脂肪酶由脂肪酶成熟肽基因編碼。
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：TQ925.6

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本文編號：2709455