【摘要】：我國(guó)蘋果種植面積廣泛,資源豐富,而每年因蘋果樹修剪等原因產(chǎn)生大量的蘋果樹枝,多被廢棄,造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。蘋果樹枝中含有豐富的黃酮類活性成分,其中二氫查耳酮類化合物根皮苷和根皮素含量較高,根皮素作為根皮苷的苷元發(fā)揮主要的藥理作用。根皮素具有大多數(shù)黃酮類化合物的特性,具有很好的脂溶性,但是水溶性較差,穩(wěn)定性差,生物利用度低,這些原因使其應(yīng)用受到了限制。目前針對(duì)根皮素的研究主要集中在其藥理活性方面,根皮素的提取、純化及其水溶性改善研究較少,且其提取純化研究也主要是利用傳統(tǒng)萃取分離技術(shù),周期長(zhǎng),得率低,質(zhì)量不高,而且較難擴(kuò)大生產(chǎn)�；谏鲜鲈�,本研究對(duì)蘋果樹枝中根皮素進(jìn)行高效綠色提取,分離純化提取液中的根皮素,獲得高純度根皮素,并以二種天然載體材料對(duì)根皮素進(jìn)行負(fù)載,以提高其水溶性和生物利用度。研究結(jié)果如下:1、以吐溫-80為表面活性劑,纖維素酶和果膠酶為復(fù)合酶,采用表面活性劑膠束輔助酶法對(duì)蘋果樹枝進(jìn)行預(yù)處理,提取根皮素的同時(shí)將部分根皮苷水解成根皮素,通過(guò)單因素和響應(yīng)面法對(duì)預(yù)處理方法進(jìn)行優(yōu)化,以根皮素總提取率和根皮素提取率為指標(biāo)(將預(yù)處理液中根皮苷按水解反應(yīng)機(jī)理折算成根皮素,計(jì)算根皮素提取率),最終得到預(yù)處理的最佳條件為:酶解溫度為55℃、酶解pH值為4.5、酶解時(shí)間為3.5 h、酶的濃度為2.5%、果膠酶與纖維素酶的比例為3:1、表面活性劑的量為5%、料液比為1:11,在此條件下,根皮素總提取率為25.18 mg/g,根皮素提取率為7.26 mg/g。在表面活性劑膠束輔助酶法預(yù)處理蘋果樹枝后,以超聲-微波協(xié)同法對(duì)蘋果樹枝中的根皮素進(jìn)行提取,獲得最佳提取條件為:超聲功率50W,料液比為1:20、表面活性劑的量為6.0%、微波功率為400 W、提取時(shí)間為6 min,在此條件下,根皮素總提取率為28.21 mg/g,根皮素提取率為10.51 mg/g。采用表面活性劑膠束輔助酶法預(yù)處理,再以超聲-微波協(xié)同法提取蘋果樹枝能夠增大根皮素的提取率,乙醇為溶劑熱回流法根皮素總提取率為22.59 mg/g,根皮素提取率為0.33 mg/g。2、采用表面活性劑膠束濁點(diǎn)分離法將根皮素提取液進(jìn)行相分離,根皮苷得率為85.4%,根皮素得率為84.9%。氯仿洗滌分相上層液,干燥后可以得到根皮苷含量為8.9%,根皮素含量為3.2%的固體粉末,進(jìn)一步采用乙醇洗滌去除多糖等雜質(zhì)、乙醇洗滌液加稀鹽酸將根皮苷水解轉(zhuǎn)化為根皮素,稀堿溶液中和,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇,乙酸乙酯萃取,最終得到根皮素含量為59.63%的根皮素粗品。以二甲基亞砜為溶劑,水為反溶劑,利用反溶劑沉淀法對(duì)根皮素粗品進(jìn)行純化,以根皮素的純度和得率為指標(biāo),通過(guò)單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化得到反溶劑沉淀純化根皮素的最佳件為:溶劑與反溶劑的體積比1:10,沉積時(shí)間5 min,沉積溫度28℃,根皮素粗品的濃度為46 mg/mL,根皮素純度和得率分別為98.11%和86.74%。采用高效液相色法、紅外光譜法、液相-質(zhì)譜法和差示量熱掃描法對(duì)純化得到的根皮素樣品進(jìn)行測(cè)定,確定純化后得到的樣品即為根皮素。3、以多孔淀粉負(fù)載根皮素,考察不同因素對(duì)多孔淀粉負(fù)載根皮素載藥量和包封率的影響,確定了多孔淀粉負(fù)載根皮素的最佳工藝條件為:吸附時(shí)間30 min,根皮素濃度150 mg/mL,根皮素與多孔淀粉的比例1:3,在此條件下,多孔淀粉負(fù)載根皮素的載藥量為12.8%,包封率為44.4%。通過(guò)掃描電鏡對(duì)根皮素、多孔淀粉、多孔淀粉負(fù)載根皮素樣品進(jìn)行形態(tài)表征,多孔淀粉負(fù)載根皮素后的形態(tài)與空白載體基本一致,吸附介質(zhì)和機(jī)械攪拌對(duì)多孔淀粉的形態(tài)和孔洞沒(méi)有影響。多孔淀粉吸附根皮素后孔洞被根皮素填充,比表面積明顯變小。通過(guò)紅外光譜、X-射線衍射和差示量熱和熱重綜合分析得出,多孔淀粉負(fù)載根皮素后,根皮素的結(jié)晶度明顯降低,根皮素基本以無(wú)定型態(tài)存在,熱重曲線中,多孔淀粉負(fù)載根皮素樣品的保留率介于根皮素和多孔淀粉之間,根據(jù)各物質(zhì)的保留率,算出多孔淀粉負(fù)載根皮素的載藥量為13.7%,結(jié)果與HPLC測(cè)得的載藥量基本一致。4、以乙醇為溶劑介質(zhì),將根皮素與羥丙基-β-環(huán)糊精以物質(zhì)的量比1:1制備根皮素包合物,木醋桿菌靜態(tài)培養(yǎng)得到細(xì)菌纖維素,再對(duì)細(xì)菌纖維素進(jìn)行冷凍、解凍處理,得到含水率為83.4%的細(xì)菌纖維素膜,以細(xì)菌纖維素膜對(duì)根皮素包合物水溶液進(jìn)行吸附,冷凍干燥制備細(xì)菌纖維素負(fù)載根皮素包合物樣品,載藥量為2.52%,包封率為57.20%。通過(guò)掃描電鏡、紅外光譜、X-射線衍射、差示量熱和熱重分析表明根皮素與羥丙基-β-環(huán)糊精以物質(zhì)的量1:1形成包合物,細(xì)菌纖維素膜中的纖維絲緊密地排列在一起,吸附了根皮素包合物水溶液的細(xì)菌纖維在冷凍干燥后呈現(xiàn)出較細(xì)菌纖維素膜更加疏松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),根據(jù)熱重曲線中各物質(zhì)的保留率,算出細(xì)菌纖維素載藥量為2.43%,結(jié)果與HPLC測(cè)定的載藥量結(jié)果基本一致。5、測(cè)定了根皮素、多孔淀粉負(fù)載根皮素、根皮素包合物和細(xì)菌纖維素負(fù)載根皮素包合物在人工胃液、pH值4.5醋酸-醋酸鈉緩沖液和人工腸液中的飽和溶解度,人工胃液介質(zhì)中分別為 29.07 μg/mL、40.43 μg/mL、49.14 mg/mL 和 48.87 mg/mL,在 pH 值4.5醋酸-醋酸鈉緩沖液介質(zhì)中分別為28.93 μg/mL、44.29μg/mL、59.81 mg/mL、60.12 mg/mL,人工腸液介質(zhì)中分別為 61.40μg/mL、81.90μg/mL、64.09 mg/mL 和 65.58 mg/mL,載藥體系三種介質(zhì)溶液中的飽和溶解度均明顯高于根皮素原藥。多孔淀粉負(fù)載根皮素、根皮素包合物和細(xì)菌纖維素負(fù)載根皮素包合物在人工胃液介質(zhì)中的累積釋放率分別是根皮素原粉的12.7倍、17.4倍、9.5倍;在pH值4.5醋酸-醋酸鈉緩沖液介質(zhì)中的累積釋放率分別是根皮素原粉的10.4倍、16.2倍、8.7倍;在人工腸液介質(zhì)中的累積釋放率分別是根皮素原粉的7.8倍、7.3倍、5.9倍,載藥體系能夠明顯提高根皮素的溶解度和溶出率。人工胃液、pH值4.5醋酸-醋酸鈉緩沖液和人工腸液中的穩(wěn)定性結(jié)果表明,根皮素及其載藥體系在人工胃液和pH值4.5醋酸-醋酸鈉緩沖液中的穩(wěn)定性較好,根皮素在人工腸液中較容易發(fā)生降解,以多孔淀粉、羥丙基-β-環(huán)糊精和細(xì)菌纖維素對(duì)根皮素負(fù)載,能夠降低根皮素的降解速度,提高根皮素的穩(wěn)定性。脂質(zhì)抗氧化、羥自由基清除能力、還原力測(cè)定結(jié)果說(shuō)明根皮素具有很好的體外抗氧化性,而且經(jīng)過(guò)負(fù)載后的根皮素體外抗氧化能力優(yōu)于根皮素原粉。6、對(duì)根皮素、多孔淀粉負(fù)載根皮素、根皮素包合物和細(xì)菌纖維素負(fù)載根皮素包合物在大鼠體內(nèi)血漿藥物濃度隨時(shí)間變化研究表明,多孔淀粉負(fù)載根皮素、根皮素包合物和細(xì)菌纖維素負(fù)載根皮素包合物的生物利用度分別是根皮素原粉的1.89倍、2.39倍、4.56倍。根皮素的組織分布情況表明根皮素、根皮素包合物組大鼠心、肝、脾、肺、腦器官中根皮素最大濃度在給藥后的1 h出現(xiàn),灌胃多孔淀粉負(fù)載根皮素、細(xì)菌纖維素負(fù)載根皮素包合物組在給藥2 h后,心、肝、脾、肺、腦器官中根皮素濃度達(dá)到最大。多孔淀粉負(fù)載根皮素、根皮素包合物、細(xì)菌纖維素負(fù)載根皮素包合物組大鼠臟器中最大根皮素濃度均高于根皮素原粉組,心臟中,分別是根皮素原粉的1.20、1.21、1.34倍,肝臟中分別是根皮素原粉的1.58、1.88、1.94倍;肺臟中分別是根皮素原粉的1.32、1.76、1.75倍,脾中分別是根皮素原粉的1.63、1.89、1.86倍,腦中分別是根皮素原粉的3.00、3.90、5.10倍;根皮素、多孔淀粉負(fù)載根皮素、根皮素包合物、細(xì)菌纖維素負(fù)載根皮素包合物組大鼠腎臟中根皮素濃度分別在給藥后的4 h、6 h、4 h、6 h達(dá)到最大值,多孔淀粉負(fù)載根皮素、根皮素包合物、細(xì)菌纖維素負(fù)載根皮素包合物在腎臟中的最大組織濃度分別是根皮素原粉的1.46、1.59、1.83倍。
【圖文】：

蘋果樹冠多呈圓形，小枝短粗圓柱形，幼枝有絨毛，芽有短柔毛，老枝無(wú)毛，逡逑一般為紫褐色。葉片長(zhǎng)度約４．５－１０邋ｃｍ，寬度約３－５．５邋ｃｍ，葉片大多為橢圓形或卵形，，逡逑先端急尖，基部闊楔形，邊緣具圓鈍鋸齒（圖１－１）。傘房花序有花３？７朵；花白色而逡逑帶紅暈；花粳長(zhǎng)１？２．５邋ｃｍ；萼宿存，裂片較萼筒長(zhǎng)，為三角狀披針形，花梗和萼均有逡逑絨毛；花瓣５枚，倒卵形；雄蕊多數(shù)；子房下位，花柱５，下半部有短的柔毛。梨果多逡逑為扁球形，大小約７ｃｍ，頂部和基部均有凹陷，蘋果樹的花期一般在４月，果期一般在逡逑－１邋－逡逑

東北林業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文一步以細(xì)菌纖維素對(duì)包合物進(jìn)行負(fù)載，以高效液相色譜法對(duì)載藥量及包封率進(jìn)行測(cè)定。逡逑皮素及其載藥體系進(jìn)行掃描電鏡、Ｘ－射線衍射、紅外光譜，分析其形貌、結(jié)構(gòu)以及穩(wěn)定性，揭示負(fù)載根皮素的機(jī)理。逡逑根皮素及其載藥體系在人工胃液、ｐＨ值４．５的醋酸－醋酸鈉度，并對(duì)其體外釋放行為以及體外抗氧化效果進(jìn)行測(cè)定，分關(guān)系。逡逑皮素及其載藥體系的大鼠血藥濃度、生物利用度、組織分在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征。逡逑路線逡逑果樹枝進(jìn)行綠色高效提取，然后分離、純化得到高純度根皮素進(jìn)行負(fù)載，，并對(duì)其進(jìn)行體外溶出、抗氧化特性以及大鼠體術(shù)路線如圖１－１０所示。＾邐逡逑蘋果樹枝－逡逑
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TQ464

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2708163