【摘要】：腺苷是一種具有重要生理生化作用的內(nèi)源性嘌呤類核苷,其主要合成方法有化學(xué)合成法和生物合成法。在生物合成法中,微生物發(fā)酵法因具有成本低、副產(chǎn)物少、對(duì)環(huán)境無(wú)毒無(wú)害等特點(diǎn),已成為了當(dāng)今社會(huì)腺苷生產(chǎn)的主要方式。目前腺苷的市場(chǎng)需求量比較大,但腺苷產(chǎn)量有限,因此如何快速提高腺苷的產(chǎn)量具有很大的研究意義。本論文首先對(duì)產(chǎn)腺苷菌株枯草芽孢桿菌BS-0的發(fā)酵性能進(jìn)行了初步研究,然后通過(guò)理化因子誘變并結(jié)合微孔板發(fā)酵初篩、搖瓶復(fù)篩,選育出高產(chǎn)且穩(wěn)定遺傳的腺苷生產(chǎn)菌株。再通過(guò)單因素、PB實(shí)驗(yàn)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和BB實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)性優(yōu)化搖瓶生產(chǎn)工藝,提高腺苷產(chǎn)量。最后通過(guò)3L發(fā)酵罐放大,優(yōu)化了腺苷發(fā)酵工藝。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:(1)出發(fā)菌株BS-0發(fā)酵性能的初步研究在出發(fā)菌株BS-0的腺苷合成能力分析基礎(chǔ)上,對(duì)其生長(zhǎng)曲線和發(fā)酵曲線進(jìn)行測(cè)定,并利用紫外-可見分光光度計(jì)法對(duì)腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行測(cè)定,明確了腺苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線表達(dá)式為Y=0.0063X,其相關(guān)性系數(shù)R2約為0.9993。對(duì)發(fā)酵中的搖瓶接種量、搖床轉(zhuǎn)速、搖瓶裝液量和紗布層數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,確定了最佳接種量為6%,250 mL搖瓶裝液量為30 mL,轉(zhuǎn)速240 r/min,4層紗布層數(shù),發(fā)酵72 h時(shí)腺苷產(chǎn)量達(dá)18.072 g/L。(2)腺苷高產(chǎn)菌株的高通量誘變選育對(duì)出發(fā)菌株枯草芽孢桿菌BS-0進(jìn)行常壓室溫等離子體(ARTP)、UV-LiCL、硫酸二乙酯(DES)和5-溴尿嘧啶(5-BU)誘變處理后,涂布于含結(jié)構(gòu)類似物6-巰基嘌呤(6-MP)的培養(yǎng)基中,獲得抗性正突變株,然后通過(guò)24微孔板發(fā)酵初篩、250 mL搖瓶發(fā)酵復(fù)篩,選育腺苷高產(chǎn)菌株。以BS-0為出發(fā)菌株進(jìn)行ARTP誘變,篩選到菌株A-2-12腺苷產(chǎn)量達(dá)19.654 g/L,較出發(fā)菌株BS-0產(chǎn)量提高了6.78%。實(shí)驗(yàn)中建立了24微孔板(裝液量為0.96 mL)和250 mL搖瓶(裝液量為30 mL)發(fā)酵腺苷產(chǎn)量的的一致性,相關(guān)性系數(shù)R2=0.8996,說(shuō)明兩者具有比較好的一致性,可以采用24微孔板代替?zhèn)鹘y(tǒng)的搖瓶發(fā)酵�？焖�?gòu)拇罅康耐蛔冎曛泻Y選出高產(chǎn)突變株,提高篩選效率。在此基礎(chǔ)上采用UV-LiCL誘變處理菌株A-2-12,微孔板發(fā)酵初篩、搖瓶復(fù)篩,得到菌株Z-30,腺苷產(chǎn)量為19.654 g/L,比菌株BS-0產(chǎn)量提高了8.75%。使用烷化劑DES處理菌株Z-30,獲得菌株D-21,產(chǎn)苷量達(dá)20.895 g/L,比菌株BS-0產(chǎn)量提高了 15.62%。采用堿基類似物5-BU處理菌株D-21,篩選到菌株5-36,其腺苷產(chǎn)量高達(dá)22.817g/L,較菌株BS-0產(chǎn)量提高了26.26%。對(duì)高產(chǎn)菌株D-21、5-3、5-5、5-6、5-36進(jìn)行傳代培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)傳代4次后各菌株產(chǎn)苷能力均有所下降,其中菌株5-36的穩(wěn)定性較好,腺苷產(chǎn)量為22.432 g/L,比出發(fā)菌株BS-0產(chǎn)量提高24.13%。(3)高產(chǎn)菌株5-36搖瓶發(fā)酵工藝的優(yōu)化對(duì)最終獲得的高產(chǎn)菌株5-36進(jìn)行搖瓶發(fā)酵工藝優(yōu)化,確定了花生餅粉、裝液量、次黃嘌呤、發(fā)酵時(shí)間、pH最適水平分別為2.0%、25 mL、0.12%、72 h、6.75,顯著因子為葡萄糖、玉米漿和CTAB。根據(jù)顯著因子設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)確定了響應(yīng)面的中心點(diǎn),響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)?zāi)M出的葡萄糖、玉米漿、CTAB的最佳濃度分別為13.874%、2.625%和0.056%,此時(shí)腺苷產(chǎn)量達(dá)23.794 g/L,經(jīng)驗(yàn)證,腺苷產(chǎn)量為23.789 g/L,較優(yōu)化前提高了6.05%,較菌株BS-0產(chǎn)量提高了31.63%。(4)高產(chǎn)菌株5-36的放大發(fā)酵優(yōu)化對(duì)腺苷高產(chǎn)菌株5-36進(jìn)行3 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng),檢測(cè)菌濃、還原糖含量、氨基氮、pH以及腺苷產(chǎn)量,未調(diào)控時(shí)腺苷產(chǎn)量為16.440 g/L。通過(guò)優(yōu)化接種量,確定了最佳接種量為4%,腺苷產(chǎn)量為19.539 g/L,較優(yōu)化前提高了 18.85%。隨后對(duì)葡萄糖的補(bǔ)加進(jìn)行了研究,結(jié)果表明腺苷發(fā)酵32 h時(shí)補(bǔ)加8%葡萄糖,發(fā)酵56 h后腺苷產(chǎn)量達(dá)23.449 g/L,較補(bǔ)料前提高了20.01%,較未調(diào)控前提高了42.63%。本論文首先對(duì)出發(fā)菌株BS-0發(fā)酵工藝進(jìn)行初步摸索,為后續(xù)研究?jī)?nèi)容的開展提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)中誘變后的菌體經(jīng)結(jié)構(gòu)類似物6-MP抗性平板分選后,通過(guò)建立微孔板和搖瓶的縮微一致性和高通量發(fā)酵,提高了篩選效率,也節(jié)省了原料。通過(guò)單因素、PB實(shí)驗(yàn)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和BB實(shí)驗(yàn)由點(diǎn)到面,系統(tǒng)的優(yōu)化了腺苷的生產(chǎn)工藝,提高了腺苷產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)3L發(fā)酵罐調(diào)控接種量、補(bǔ)加葡萄糖,腺苷產(chǎn)量較未調(diào)控前有明顯提高。研究結(jié)果對(duì)于腺苷的生產(chǎn)具有重要的理論與參考價(jià)值。
【圖文】：

逑ＧＲ逡逑圖１－２枯草芽孢桿菌利用葡萄糖作碳源合成腺苷全合成途徑逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｔｏｔａｌ邋ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋ｏｆ邋Ｂａｃｉｌｌｕｓ邋ｓｕｂｔｉｌｉｓ邋ｕｓｉｎｇ邋ｇｌｕｃｏｓｅ邋ａｓ邋ｃａｒｂｏｎ邋ｓｏｕｒｃｅ逡逑可以降低腺苷酸脫氨酶活性防止產(chǎn)物腺苷的分解也可以增強(qiáng)５＇－核苷酸酶的活性［４３３。也逡逑可以選育抗腺苷結(jié)構(gòu)類似物的菌株如抗６－疏基嘌呤（６－ＭＰ）的菌株。此外，改變細(xì)胞膜的逡逑通透性，使胞內(nèi)腺苷不斷向胞外分泌。消除腺苷（酸）對(duì)琥珀酸腺苷酸合成酶的反饋抑制逡逑也是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。逡逑目前腺苷產(chǎn)生菌菌株大多是經(jīng)過(guò)化學(xué)或者物理誘變所得，再用一般的誘變劑和單一逡逑誘變劑處理時(shí)很難再篩選出更高產(chǎn)量的菌株，所以今后研究者可以考慮使用新的誘變手逡逑段，提高誘變效率［４２］。逡逑１．５研究?jī)?nèi)容和技術(shù)路線逡逑１．５．１研究?jī)?nèi)容逡逑腺苷是一種具有重要生理生化作用的內(nèi)源性核苷，發(fā)酵法產(chǎn)腺苷具有明顯的優(yōu)勢(shì)逡逑［４４，４５］。本文通過(guò)對(duì)腺苷產(chǎn)生菌的黃嘌呤缺陷型的枯

圖２－２腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線逡逑Ｆｉｇ．邋２－２邋Ｓｔａｎｄａｒｄ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋ａｄｅｎｏｓｉｎｅ逡逑的測(cè)定逡逑變和發(fā)酵均需要代謝旺盛的種子液，一般對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期知，菌體適應(yīng)期較長(zhǎng)，１４邋ｈ至１８邋ｈ菌體快速增多，３０邋ｈ誘變?nèi)∮茫保粗粒保稿澹璧姆N子液最佳，此時(shí)菌體生長(zhǎng)快，，１１逡逑
【學(xué)位授予單位】：安徽工程大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TQ920.6

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5 申s

本文編號(hào)：2698216