發(fā)布時(shí)間：2020-05-25 18:15

【摘要】：卡拉膠(Carrageenans或Carrageenins)是從可食用紅藻(角叉菜、杉藻等)中提取的一類線性硫酸海藻多糖,具有較好的凝膠性、增稠穩(wěn)定性等,被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中,同時(shí)卡拉膠多糖具有較好的抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等功能活性。然而,高分子卡拉膠多糖粘度大,在生物機(jī)體內(nèi)難以被吸收,限制了其功能活性的應(yīng)用,而降解后得到的半乳寡糖硫酸酯容易吸收、毒性低,活性基團(tuán)大量暴露。因此,高效制備卡拉膠寡糖是推進(jìn)紅藻寡糖精深加工及應(yīng)用的重要途徑。本論文以κ-卡拉膠為目的碳源,從角叉菜海藻中篩選可有效酶解κ-卡拉膠的新型細(xì)菌,對(duì)其進(jìn)行分子水平鑒定,并建立該菌株的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型;采用固定化微生物技術(shù),以磁性Fe304-Chitosan為載體,制備菌體高濃度富集的固定菌微球,用于高效連續(xù)制備K-卡拉膠酶及κ-卡拉膠寡糖,并分析固定化結(jié)合機(jī)理;采用切向超濾膜技術(shù)對(duì)K-卡拉膠寡糖進(jìn)行初步分級(jí),進(jìn)一步使用中低壓制備色譜聯(lián)合蒸發(fā)光散射檢測(cè)器快速分離純化得到K-卡拉膠寡糖單體,采用ESI-MS、CID-MS/MS及NMR等檢測(cè)技術(shù)分析各寡糖結(jié)構(gòu)序列;以LPS構(gòu)造巨噬細(xì)胞(RAW264.7)炎癥模型為研究對(duì)象,評(píng)價(jià)對(duì)比K-卡拉膠寡糖各單體的免疫防御功效�；谙到y(tǒng)生物學(xué)分析方法,建立K-卡拉膠寡糖干預(yù)巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖,從蛋白質(zhì)組學(xué)水平闡明其作用機(jī)理。首先,從角叉菜海藻中分離獲得一株可有效降解κ-卡拉膠的菌株,經(jīng)16S rDNA鑒定為海旋菌屬,并命名為Thalassospira sp.Fjfst-332(TF-332)。通過 Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化,菌株 TF-332發(fā)酵產(chǎn)κ-卡拉膠酶的最佳發(fā)酵參數(shù)為:溫度25℃、pH 7.0、接種量3 mL、裝液量30mL、轉(zhuǎn)速125r/min;發(fā)酵培養(yǎng)基配方:2g/Lκ-卡拉膠、1g/L 酵母膏、20g/LNaCl、1g/LFOS、2g/LNaNO3、0.5g/L MgSO4·7H2O、1g/LK2HPO4和 0.1 g/LCaC12,在此最優(yōu)工藝參數(shù)下,檢測(cè)得到最高酶活為267 U/mL。分別建立菌株TF-332在不同發(fā)酵條件下的經(jīng)驗(yàn)生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型和產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)模型方程,該模型的建立可為菌株工業(yè)化發(fā)酵過程的調(diào)控提供理論依據(jù)。采用固定化微生物技術(shù),以磁性Fe3O4-Chitosan為載體,制備菌體高濃度富集的固定菌微球,通過多種物理方法(XRD、VSM、FTIR、SEM、CLSM、Raman spectra)對(duì)固定菌進(jìn)行表征并發(fā)現(xiàn)菌株TF-332與載體Fe3O4-Chitosan通過殼聚糖表面的amide Ⅱ(-NH2)基團(tuán)有效結(jié)合。載體Fe3O4-Chitosan吸附菌體的最佳參數(shù)為:20℃條件下吸附作用3 h;固定菌發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳參數(shù)為:培養(yǎng)基初始pH 7.0、發(fā)酵溫度30℃、固定菌添加量700mg/30mL。另一方面,與游離菌TF-332發(fā)酵相比,固定菌IMB發(fā)酵生產(chǎn)κ-卡拉膠酶的效率提高了 41.7%,κ-卡拉膠酶產(chǎn)量提高了 66.7%,并且在7個(gè)重復(fù)使用周期后,菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的能力為初始菌株的66.18%。結(jié)果表明固定菌有效提高了游離菌發(fā)酵產(chǎn)酶效率和產(chǎn)酶量,且發(fā)酵穩(wěn)定性相對(duì)游離菌顯著增強(qiáng),可用于K-卡拉膠酶及κ-卡拉膠寡糖連續(xù)性批量生產(chǎn)。為了深入研究κ-卡拉膠寡糖的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,研究采用中低壓制備色譜-蒸發(fā)光散射系統(tǒng)分離純化制備K-卡拉膠寡糖單體,最佳分離純化工藝參數(shù)為:流速4mL/min,上樣濃度1.0g/mL,進(jìn)樣體積為1mL,流動(dòng)相為0.1MNH4HCO3,在此參數(shù)下,分離純化得到四種K-卡拉膠寡糖單體,純品總得率為5.02%。經(jīng)ESI-MS及CIE-MS/MS檢測(cè),這四種寡糖分別為分子量404 Da、807 Da、1210 Da、1273 Da的κ-卡拉膠二糖、四糖、六糖及雜合型κ/ι-卡拉膠六糖。核磁共振分析結(jié)果表明,該酶解寡糖系列以G4S為還原端,結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)式分別為:α-DA-1→3-G4Srα/β(κ-卡拉膠二糖);α-DA-1→3-β-G4S-1→→4-α-DA-1→3-G4Srα/β(κ-卡拉膠四糖);α-DA-1→3-β-G4S-1→4-α-DA-1 →3-β-G4S-1→4-α-DA-1 →3-G4Srα/β(K-卡拉膠六糖);α-DA/DA2S-1→3-β-G4S-1-4-α-DA-1→3-β-G4S-1→4-α-DA-1→3-G 4Srα/β(κ/ι-卡拉膠六糖)。采用LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW264.7為炎癥細(xì)胞模型,研究純?chǔ)?卡拉膠寡糖的免疫防御功效。試驗(yàn)結(jié)果表明,四種純?chǔ)?卡拉膠寡糖在劑量濃度75 μg/mL內(nèi)無細(xì)胞毒性,當(dāng)劑量濃度大于300μg/mL時(shí),巨噬細(xì)胞存活率顯著下降。此外,四種K-卡拉膠寡糖從生理水平及轉(zhuǎn)錄水平上分別劑量依賴性地抑制了炎癥介質(zhì)(ROS、NO、TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10)的分泌,同時(shí)對(duì)iNOS及COX-2蛋白的表達(dá)也起到了抑制效果,降低了細(xì)胞炎癥反應(yīng),表明κ-卡拉膠寡糖具有免疫防御功效,四種κ-卡拉膠寡糖的免疫防御能力表現(xiàn)為KCO-4KCO-3KCO-2KCO-1,即聚合度越高的κ-卡拉膠寡糖免疫調(diào)節(jié)效果越好,同一聚合度下硫酸基團(tuán)含量越多的κ-卡拉膠寡糖免疫防御功效較好。采用蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù),從蛋白質(zhì)組水平上分析四種κ-卡拉膠寡糖的免疫防御機(jī)制。首先,通過高通量檢測(cè),共鑒定了 4547個(gè)蛋白質(zhì),以LPS實(shí)驗(yàn)組為對(duì)照組,KCO-1、KCO-2、KCO-3、KCO-4組分別篩選出236、370、450、135個(gè)差異蛋白質(zhì)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從整體蛋白功能層面分析,KCO-1組的差異蛋白功能表征相對(duì)其他三組具有較大差異性,差異蛋白在細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡與增殖、DNA復(fù)制等功能模塊具有較大的富集。KCO-2、KCO-3及KCO-4組的差異蛋白在蛋白功能表征方向具有相似性,差異蛋白主要參與RNA轉(zhuǎn)錄后修飾、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、機(jī)體損傷等相關(guān)信號(hào)通路。從LPS誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)通路層面分析,四種κ-卡拉膠寡糖預(yù)處理巨噬細(xì)胞后,當(dāng)LPS入侵巨噬細(xì)胞,經(jīng)典炎癥通路上的三個(gè)關(guān)鍵蛋白質(zhì)CD14、Rel、p50均表現(xiàn)出了顯著下調(diào)現(xiàn)象,說明由CD14觸發(fā),Rel、p50介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路(CD14/Rel@p50)受到抑制,即κ-卡拉膠寡糖通過抑制NF-κB信號(hào)通路上的蛋白CD14、Rel、p50表達(dá),從而起到免疫防御效果,抑制相關(guān)炎癥因子NO、ROS、TNF-α、IL-1β、IL-8等的過量分泌。該研究成果為進(jìn)一步開發(fā)κ-卡拉膠寡糖功能食品奠定重要的理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

研究采用Ｋ－卡拉膠作為唯一的碳源誘導(dǎo)篩選可降解Ｋ－卡拉膠多糖的微生物。逡逑其中，菌株ＴＦ－３３２在平板培養(yǎng)基上發(fā)酵培養(yǎng)后表現(xiàn)出最佳降解能力，即形成明逡逑顯的凹形液化圈（圖２－１Ａ）。根據(jù)Ｂｅｒｇｅｙ手冊(cè)檢測(cè)分析該菌株的生理生化特征逡逑（表２－２）并采用ＴＥＭ電鏡掃描分析菌株基本形態(tài)如圖所示（圖２－１Ｂ）。逡逑ＰＣＲ測(cè)序分析，細(xì)菌１６ＳｒＤＮＡ序列經(jīng)比對(duì)與海旋菌（Ｕｔｍａｖｐ／Ｖａｓｐ．）逡逑＋柯邋９８．７％的同源性（ＧｅｎＢａｎｋ邋Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ邋Ｎｕｍｂｅｒ邋ＥＵ４４０７９０），序列大小為邋１４８７邋ｂｐ。逡逑采用Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｉｏｎｉｎｇ邋（ＭＥＧＡ６．邋０６）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖２－２所示，可看出與該逡逑菌株最為接近的細(xì)菌種屬為海旋菌屈７７ｉｒｔ／ｆｌｉ＼ｙ0ｓ７；／＞＜７ｓｐ．，這與ＢＬＡＳＴ比對(duì)結(jié)－逡逑？致，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，將該細(xì)菌鑒定為海旋晸，并將其命名為ＴＶｗ／ａＭｔｔｖｐ／ｒｃ／ｓｐ．逡逑Ｆｊｆｓｔ－３３２邋（ＴＦ－３３２）。海旋菌是一種海洋細(xì)菌，其降解功能主要逡逑集屮在水解烷烴和多環(huán)芳烴對(duì)卡拉膠的酶解功能目前還未見具體報(bào)道

逑２．３．５爬坡設(shè)計(jì)Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ邋（ＰＢ）篩選顯著變量逡逑２水平１１因素的ＰＢ設(shè)計(jì)如表２－３所示，結(jié)果如表２－４所示。圖２－５闡述了逡逑Ｐａｒｅｔｏ邋Ｃｈａｒｔ邋（／？＜邋０．０５）的顯著性結(jié)果。Ｋ－卡拉膠、ＮａＣｌ、酵母膏及低聚果糖的逡逑ｔ值均大于ｔ－ｖａｌｕｅｌｉｍｉｔｅ邋（ｔ＞２．３６４６２），說明了預(yù)測(cè)值是顯著、可接受的。根據(jù)逡逑ＰＢ設(shè)計(jì)及Ｐａｒｅｔｏ邋Ｃｈａｒｔ的回歸結(jié)果可知響應(yīng)不存在任何顯著虛擬值，意味著ＰＢ逡逑設(shè)計(jì)不存在系統(tǒng)誤差和未知誤差。對(duì)于酶活來說，ｋ－卡拉膠、ＮａＣｌ、酵母膏及低逡逑聚果糖Ｆ０Ｓ為顯著因子（圖２－５Ａ）。對(duì)于菌株生長(zhǎng)量來說，ＮａＣｌ表現(xiàn)出顯著的逡逑抑制效果（圖２－５Ｂ），即表明菌株ＴＦ－３３２對(duì)高鹽環(huán)境較為敏感且低濃度的ＮａＣｌ逡逑有利于菌株生長(zhǎng)。除此之外，Ｋ－卡拉膠、酵母膏及低聚果糖ＦＯＳ對(duì)菌株生長(zhǎng)量逡逑具有正向顯著效果�？傊�，Ｋ－卡拉膠、：ＮａＣｌ、酵母膏及低聚果糖ＦＯＳ為影響Ｋ－逡逑卡拉膠酶酶活及菌株ＴＦ－３３２生長(zhǎng)量的顯著變量
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：TQ929

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本文編號(hào)：2680548