發(fā)布時(shí)間：2020-05-15 06:17

【摘要】：益生元多為一種在胃腸道上段不易消化的碳水化合物,它通過(guò)對(duì)菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)來(lái)產(chǎn)生有利于人體健康的作用。益生元已被報(bào)道具有多種生理功能,例如通便、抗癌、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和改善免疫作用的健康功效等。目前體外評(píng)估益生元的方式主要有兩種1)體外發(fā)酵模型;2)體外細(xì)胞模型。通過(guò)上述兩種模型的結(jié)合,我們不僅可以觀(guān)察益生元對(duì)發(fā)酵菌群結(jié)構(gòu)以代謝產(chǎn)物的調(diào)整,而且可以揭示發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的生理功效。然而,在使用細(xì)胞模型方面仍存在稍許不足:首先,現(xiàn)有測(cè)定方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞反應(yīng)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè);其次,關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)因素如上樣體積和作用時(shí)間尚未確定。為了解決上述不足,本研究引進(jìn)一種新的技術(shù)平臺(tái)——細(xì)胞實(shí)時(shí)功能分析(RTCA SP)系統(tǒng)。該系統(tǒng)的核心是底部整合有微電子傳感器的細(xì)胞檢測(cè)板。細(xì)胞反應(yīng)以基于微電極阻抗的細(xì)胞指數(shù)的形式呈現(xiàn)。它具有實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)自動(dòng)采集和實(shí)時(shí)分析的優(yōu)勢(shì)。為了標(biāo)準(zhǔn)化基于RTCA SP系統(tǒng)以Caco-2細(xì)胞模型評(píng)估益生元時(shí)的上樣體積以及作用時(shí)間,我們?cè)O(shè)計(jì)了如下實(shí)驗(yàn):1)測(cè)定3種不同SCFAs混合液對(duì)Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響;2)對(duì)低聚果糖(FOS)和抗性淀粉(RS)發(fā)酵上清的動(dòng)態(tài)測(cè)定。我們發(fā)現(xiàn)Caco-2細(xì)胞對(duì)SCFAs混合液的耐受范圍為0-8 mmol/L。據(jù)此設(shè)定益生元發(fā)酵上清的上樣體積為6.3%(v/v)。我們也發(fā)現(xiàn)益生元發(fā)酵上清作用于Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)模型和腸屏障模型的時(shí)間范圍分別是0-16h和0-72h。所以在比較FOS和RS的生理功效時(shí)我們挑取的數(shù)據(jù)分別來(lái)自16h(Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng))和72h(Caco-2單細(xì)胞層屏障功能)。FOS和RS在兩種營(yíng)養(yǎng)條件下(PBS體系和BCM體系)與新鮮糞便進(jìn)行厭氧發(fā)酵。采用RTCA SP系統(tǒng)以及上述實(shí)驗(yàn)參數(shù)評(píng)估FOS和RS的發(fā)酵上清。我們發(fā)現(xiàn)FOS和RS均可以刺激Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)和增強(qiáng)Caco-2單細(xì)胞層屏障功能;特別是在PBS體系,FOS和RS(發(fā)酵24h和72h)的上清可以顯著地促進(jìn)Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)。為了驗(yàn)證上述結(jié)果的準(zhǔn)確性,我們對(duì)對(duì)響應(yīng)益生元的關(guān)鍵OTUs豐度以及發(fā)酵上清中SCFAs的含量進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOS和RS發(fā)酵上清的生理功能同益生元富集的SCFAs產(chǎn)生菌Faecalibacterium和Roseburia呈顯著正相關(guān);同潛在致病菌Oscillibacter,Bilophila,Escherichia/Shigella和Streptococcus呈顯著負(fù)相關(guān)。FOS和RS發(fā)酵上清對(duì)Caco-2單細(xì)胞層屏障功能的增強(qiáng)作用同乙酸、丙酸、丁酸和總酸的含量呈顯著正相關(guān);同異丁酸的含量呈負(fù)相關(guān)。綜上所述,本研究將RTCA SP系統(tǒng)引入到對(duì)益生元發(fā)酵上清作用效果的評(píng)估中,并確定了Caco-2細(xì)胞模型在該系統(tǒng)中的評(píng)估體系的上樣體積和作用時(shí)間,在此基礎(chǔ)上對(duì)FOS和RS發(fā)酵上清的生理功效了進(jìn)行評(píng)估。根據(jù)FOS和RS發(fā)酵上清的生理功效與發(fā)酵液的菌群結(jié)構(gòu)的改變及發(fā)酵上清中SCFAs含量的關(guān)聯(lián)分析,揭示了FOS和RS通過(guò)調(diào)整發(fā)酵菌群的群落結(jié)構(gòu)而影響其代謝產(chǎn)物,進(jìn)而刺激Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)和增強(qiáng)Caco-2單細(xì)胞層屏障功能。本研究表明了利用RTCA SP系統(tǒng)對(duì)益生元作用功效進(jìn)行體外評(píng)估的可靠性。
【圖文】：

圖 1-1 . SCFAs 發(fā)揮作用的主要途徑。Figure1-1 Fermentation of dietary fiber leads to the production of SCFAs via various biochemical pathwahe size of the letters symbolizes the ratio of SCFAs present. In the distal gut, SCFAs can enter the cells throiffusion or SLC5A8-mediated transport and act as an energy source or an HDAC inhibitor. Luminal acetatropionate sensed by GPR41 and GPR43 releases PYY and GLP-1, affecting satiety and intestinal tranuminal butyrate exerts anti-inflammatory effects via GPR109A and HDAC inhibition. Furthermore, propionan be converted into glucose by IGN, leading to satiety and decreased hepatic glucose production. SCFAs lso act on other sites in the gut, like the ENS, where they stimulate motility and secretory activity, or the immells in the lamina propria, where they reduce inflammation and tumorigenesis. Small amounts of SCFAs (mocetate and possibly propionate) reach the circulation and can also directly affect the adipose tissue, brain, ver, inducing overall beneficial metabolic effects. Solid arrows indicate the direct action of each SCFA, ashed arrows from the gut are indirect effects.乙酸是可以到達(dá)外周循環(huán)的含量最豐富的 SCFAs，最近報(bào)道可以跨過(guò)血腦屏障被腦從而直接影響飲食控制中樞[15]。它主要是和 GPR43 結(jié)合，，在代謝上抑制脂類(lèi)分解[15加胰島素敏感性[16]和能量消耗、促進(jìn) PYY 和 GLP-1 的分泌、前體脂肪細(xì)胞的分化和控制[17,18]；在癌癥和 IBD 方面可以防治 IBD、在結(jié)腸炎動(dòng)物模型中減輕炎癥和促進(jìn)腸癌細(xì)胞的凋亡；免疫方面

健康個(gè)體 BMP 組和 BME 組丁酸的濃度無(wú)顯著性差異，但在 2 型糖尿病個(gè)體中則恰恰相反(圖 1C; 圖 1D; 圖1E; 圖 1H; 圖 1I; 圖 1J)。圖 1 苦瓜制品發(fā)酵上清 pH 和 SCFAs 濃度的測(cè)定。A-E：健康個(gè)體；F-J：2 型糖尿病個(gè)體。相同字母表示組內(nèi)無(wú)顯著性差異(p>0.05, 單因素方差分析, Tukey 后檢驗(yàn))Figure 1 Determination of pH and SCFAs concentrations in the fermentation supernatant of bitter melon preparations. A -EHealthy individual; F-J T2D patient. Same letter represents no significant difference within the group (p >0.05, One-Way ANOVA，
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：TQ920.1

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本文編號(hào)：2664604