【摘要】：木聚糖酶是能將木聚糖降解成低聚木糖或木糖的復(fù)合酶系,主要包括內(nèi)切β-1,4-D-木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-D-葡萄糖醛酸苷酶、乙�；揪厶敲负头铀狨ッ�,可降解自然界中大量存在的木聚糖類半纖維素。因此,木聚糖酶可以廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、能源、造紙和飼料等行業(yè)和領(lǐng)域。本研究所使用的異硫鏈霉菌(Streptomyces althioticus)主要產(chǎn)內(nèi)切β-1,4-D-木聚糖酶,其可以隨機(jī)切割木聚糖主鏈骨架的β-1,4糖苷鍵產(chǎn)生木糖和低聚木糖或帶有側(cè)鏈的寡聚木糖。本研究首先通過(guò)紫外和亞硝酸鈉復(fù)合誘變的方法篩選出一株產(chǎn)木聚糖酶活較高的菌株,然后通過(guò)單因素優(yōu)化篩選出了碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽等成分,再通過(guò)Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和不顯著因素的最低添加量實(shí)驗(yàn),最后通過(guò)Central Composite Design設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)等方法對(duì)該菌株產(chǎn)木聚糖酶的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化,同時(shí)對(duì)分離純化后的木聚糖酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)研究,最后研究了該酶與纖維素酶協(xié)同作用水解玉米芯粉的效果,主要研究結(jié)果如下。(1)通過(guò)紫外和亞硝酸鈉復(fù)合誘變的方法,篩選得到一株產(chǎn)木聚糖酶活力最高的菌株,經(jīng)測(cè)定該菌株產(chǎn)木聚糖酶活為40.21U/m L。通過(guò)測(cè)定細(xì)胞干重的方法測(cè)得該菌株的生長(zhǎng)曲線為,0h~4h為適應(yīng)期、4h~28h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、28h~36h為穩(wěn)定期。因此,在后期發(fā)酵時(shí),選擇生長(zhǎng)24h的細(xì)胞作為種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中。(2)采用單因素優(yōu)化法確定了菌株產(chǎn)木聚糖酶的最適發(fā)酵條件為發(fā)酵周期108h,發(fā)酵溫度40℃,接種量4%,搖床轉(zhuǎn)速為180r/min,裝液量50m L/250m L,初始發(fā)酵p H為7.0。通過(guò)Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)篩選出對(duì)菌株產(chǎn)木聚糖酶活力有顯著性影響的成分,然后通過(guò)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和不顯著因素的最低添加量實(shí)驗(yàn),確定了培養(yǎng)基中各組分的添加量,最后通過(guò)Central Composite Design設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成,分別為玉米芯粉12.77g/L、硝酸鉀1.67g/L和磷酸氫二鈉1.45g/L,其他培養(yǎng)基組分為磷酸氫二鉀0.4g/L、磷酸二氫鈉0.4g/L和磷酸二氫鉀0.4g/L。預(yù)測(cè)酶活為184.6U/m L,實(shí)驗(yàn)測(cè)得酶活為178U/m L,結(jié)果相差不大,說(shuō)明采用上述一系列優(yōu)化方法得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是合理可靠的。優(yōu)化發(fā)酵條件和培養(yǎng)基組成后,木聚糖酶酶活是優(yōu)化前的4.4倍。(3)通過(guò)硫酸銨分級(jí)鹽析、Hi Prep 26/10 Desalting脫鹽、Hiprep DEAE FF 16/10離子交換層析和Sephadex G-100凝膠過(guò)濾層析等分離純化步驟,純化倍數(shù)達(dá)到10.37,最終得到比酶活為952U/mg的高純度樣品,通過(guò)SDS-PAGE法測(cè)得分子量約為35.0KDa。對(duì)分離純化后的木聚糖酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究,得到木聚糖酶最適反應(yīng)溫度為55℃,在40℃、45℃和50℃條件下保溫4h,殘余酶活相對(duì)穩(wěn)定,說(shuō)明該酶在40℃~50℃溫度范圍內(nèi)有很好的穩(wěn)定性。該木聚糖酶最適反應(yīng)p H為5,在p H4~p H9范圍內(nèi)保溫4h,殘余酶也具有較好的穩(wěn)定性。(4)通過(guò)單因素法分別優(yōu)化了木聚糖酶、纖維素酶以及木聚糖酶和纖維素酶協(xié)同作用水解玉米芯粉的最佳條件,用木聚糖酶水解未預(yù)處理玉米芯粉的最佳條件為p H6,酶添加量為110U,水解時(shí)間為7h,產(chǎn)生的還原糖量為7.38mg;用纖維素酶水解未預(yù)處理玉米芯粉在p H5.5,酶添加量為150U,水解時(shí)間為28h,產(chǎn)生的還原糖量為39.69mg;先用纖維素酶再用木聚糖酶水解玉米芯粉的最佳條件為p H5.5,酶添加量為110U,水解時(shí)間為7h,產(chǎn)生的還原糖量為4.08mg;先用木聚糖酶再用纖維素酶水解玉米芯粉的最佳條件為p H4.5,加酶量為230U,產(chǎn)生的還原糖量為49.53mg。同時(shí),探討了玉米芯粉經(jīng)過(guò)蒸汽爆破預(yù)處理后,再分別用這四種工藝水解玉米芯粉,產(chǎn)生的還原糖量分別為,經(jīng)過(guò)木聚糖酶水解玉米芯粉產(chǎn)生的還原糖量為9.48mg,纖維素酶水解水解玉米粉產(chǎn)生的還原糖量為52.56mg,先用纖維素酶再用木聚糖酶水解玉米芯粉產(chǎn)生還原糖量為8.27mg,先用木聚糖酶再用纖維素酶水解玉米芯粉產(chǎn)生還原糖量為64.89mg。結(jié)果表明預(yù)處理后的玉米芯粉,先用木聚糖酶再用纖維素酶水解產(chǎn)生的還原糖量最高。此外,采用高效液相色譜法分析了經(jīng)過(guò)木聚糖酶和纖維素酶水解玉米芯粉后的產(chǎn)物,經(jīng)過(guò)纖維素酶水解玉米芯粉的主要產(chǎn)物為葡萄糖、纖維二糖和木糖。木聚糖酶水解玉米芯粉的主要產(chǎn)物為木糖、木二糖、木三糖,只有少量的木四糖存在于木聚糖酶水解預(yù)處理玉米芯粉中。對(duì)經(jīng)過(guò)水解的玉米芯粉顆粒表面進(jìn)行電鏡掃描觀察,發(fā)現(xiàn)玉米芯粉通過(guò)酶水解后,其表面變得比原來(lái)更粗糙一些,顆粒徑變得更小,顆粒表面上出現(xiàn)了一些小孔,這進(jìn)一步驗(yàn)證了纖維素酶和木聚糖酶對(duì)玉米芯粉的水解作用非常明顯。
【圖文】：

Table 3.13 Analysis of variable(ANOVA) for Central Composite Designsource SS DF MS F PModel 42899.01 9 4766.56 147.09 <0.0001* 顯著A-玉米芯粉 4056.47 1 4056.47 125.18 <0.0001* 顯著B-硝酸鉀 2534.56 1 2534.56 78.21 <0.0001* 顯著C-磷酸氫二鈉 83.13 1 83.13 2.57 0.1403AB 734.44 1 734.44 22.94 0.0007*AC 4.99 1 4.99 0.15 0.7029BC 2.69 1 2.69 0.083 0.7791A226604.83 1 9604.01 820.99 <0.0001*B29947.96 1 1199.21 306.98 <0.0001*C24358.31 1 0.82 134.49 <0.0001殘差 324.06 10 32.41失擬項(xiàng) 233.59 5 46.72 2.58 0.1606 不顯著純誤差 90.47 5 18.09總離差 43223.07 19

圖 4.5 木聚糖酶各步分離純化電泳圖白質(zhì) Marker，Lane 1：粗酶液，Lane 2：硫酸銨鹽析，Lan酶液，Lane 4：離子交換后酶液，Lane 5：凝膠過(guò)濾后酶液Figure 4.5 SDS-PAGE of xylanase purification：protein Marker，Lane 1：crude enzyme，Lane 2：ammoiumtation，Lane 3：active fraction of Desalting，Lane 4：active frion-exchange，，Lane 5：active fraction of gel filtration糖酶學(xué)性質(zhì)研究聚糖酶最適溫度和溫度穩(wěn)定性6080100酶酶%)(
【學(xué)位授予單位】：湖北工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：TQ925

【參考文獻(xiàn)】

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