發(fā)布時(shí)間：2020-05-03 15:50

【摘要】：蚓激酶(Lumbrokinase,LK)是蚯蚓體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一組同時(shí)具有纖溶活性和激酶活性的絲氨酸蛋白酶。該酶能夠刺激纖溶酶原轉(zhuǎn)變成纖溶酶,從而催化纖維蛋白,起到溶血栓作用。該酶穩(wěn)定性良好,其酶制劑既能口服,亦可注射,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用。目前蚓激酶基因已在真菌、細(xì)菌和動(dòng)物細(xì)胞中成功進(jìn)行表達(dá),但表達(dá)效果不夠理想。本論文從土壤中篩選得到野生蚯蚓,鑒定為赤子愛勝蚓,并克隆得到蚓激酶基因lks2。以乳酸克魯維酵母和巴斯德畢赤酵母為宿主,成功構(gòu)建重組菌GG799-p KLAC1-lks2和GS115-p PIC9K-lks2。通過高密度發(fā)酵及過程控制,成功實(shí)現(xiàn)蚓激酶在畢赤酵母中的高表達(dá),最高酶活達(dá)1140.8 U/m L。主要研究工作如下:(1)從校園土壤中篩選得到野生蚯蚓,利用分子生物學(xué)鑒定為赤子愛勝蚓。提取蚯蚓總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到c DNA,克隆得到蚓激酶基因lks2。利用DNAMAN等生物信息學(xué)軟件對基因分析,該基因全長738 bp,共編碼245個(gè)氨基酸,與已報(bào)導(dǎo)F238(Gene Bank No.DQ202401)基因同源性為99.59%,其中第136、175和398位堿基不同,導(dǎo)致編碼的46和59位氨基酸發(fā)生差異。對蚓激酶LKS2進(jìn)行分子建模和底物對接,預(yù)測得到該酶的催化活性中心(Tyr167-Ile218-Gly219-Asp189-Gly219)。(2)成功構(gòu)建重組質(zhì)粒p KLAC1-lks2,實(shí)現(xiàn)蚓激酶基因在乳酸克魯維酵母GG799中的表達(dá)。經(jīng)優(yōu)化確定重組菌最佳培養(yǎng)基為:葡萄糖25.0 g/L、酵母粉10.0 g/L、蛋白胨20.0 g/L、KH2PO4 10.0 g/L。此條件下產(chǎn)酶效果最佳,酶活在72 h達(dá)到峰值140.4 U/m L。(3)構(gòu)建載體p PIC9K-lks2,實(shí)現(xiàn)蚓激酶基因lks2在巴斯德畢赤酵母GS115中的表達(dá)。經(jīng)優(yōu)化確定最佳誘導(dǎo)條件為:初始菌體量OD600=1.5,p H 5.5,溫度28℃。此外,添加0.1%的絲氨酸能有效提高重組菌產(chǎn)酶能力。在最佳條件下,經(jīng)甲醇誘導(dǎo)84 h,蚓激酶活力達(dá)到峰值為397.6 U/m L,較優(yōu)化前提高了56.3%。(4)在搖瓶優(yōu)化基礎(chǔ)上,利用10 L發(fā)酵罐對重組菌GS115-p PIC9K-lks2進(jìn)行高密度發(fā)酵條件優(yōu)化,確定最佳菌體接種濃度為9±0.5 g/L。此外,添加0.5%酵母浸粉能夠促進(jìn)產(chǎn)酶。經(jīng)發(fā)酵過程控制,蚓激酶活力最高達(dá)1140.8 U/m L,較優(yōu)化前的前期培養(yǎng)時(shí)間縮短11.5 h,酶活提高1.16倍。
【圖文】：

圖 2-1 蚯蚓基因組電泳arthworm genome electro單一條帶，，分子量大小圖 2-2 18SrDNA 電泳圖2 18SrDNA electrophores

8SrDNA電泳圖
【學(xué)位授予單位】：安徽工程大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：TQ925

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 郝春華;李亞麗;孫雙勇;王維亭;趙專友;;缺血性腦中風(fēng)急性期溶栓藥物研究進(jìn)展[J];中國新藥雜志;2015年23期

2 陳霞;;認(rèn)識(shí)血栓 遠(yuǎn)離血栓病[J];中南藥學(xué)(用藥與健康);2015年11期

3 陳臻毅;侯學(xué)文;蘇志堅(jiān);邱道壽;;蚓激酶F-Ⅲ-1基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2015年17期

4 汪艷;李曉;陳勇;武運(yùn);;來源于瘤胃厭氧真菌Neocallimastix frontalis木聚糖酶在畢赤酵母中的表達(dá)[J];生物技術(shù)通報(bào);2015年05期

5 馮俠俠;朱蓓德;許向東;孟擁軍;王櫻華;;抗凝藥比伐盧定臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J];藥學(xué)服務(wù)與研究;2015年01期

6 榮博涵;甄玉國;趙小麗;劉乙辰;冀紅芹;;不同補(bǔ)料方式對釀酒酵母高密度發(fā)酵的影響[J];中國釀造;2015年02期

7 吳莎莎;蔣龍?jiān)?;抗血小板藥物研究進(jìn)展及臨床應(yīng)用情況[J];嶺南急診醫(yī)學(xué)雜志;2014年01期

8 馬銀鵬;王玉文;黨阿麗;孔祥輝;張介馳;;畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展[J];黑龍江科學(xué);2013年09期

9 徐紅兵;王ZL嫻;花紅林;;蚓激酶治療急性腦梗死的療效觀察[J];工企醫(yī)刊;2011年05期

10 周海;王春維;張怡;劉翼;;蚓激酶的提取純化及性質(zhì)研究[J];中國生化藥物雜志;2011年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 李松;米根霉CICIM F0071α-淀粉酶：基因克隆、鑒定與異源表達(dá)[D];江南大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 董玉穩(wěn);匍枝根霉組成型內(nèi)切葡聚糖苷酶基因的克隆、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究[D];安徽工程大學(xué);2014年

2 宋馨宇;蚓激酶基因F238在畢赤酵母和枯草芽孢桿菌中的表達(dá)[D];天津科技大學(xué);2011年

3 孔航天;蚓激酶基因在原核和畢赤酵母中的表達(dá)[D];吉林大學(xué);2008年

本文編號(hào)：2647761