【摘要】：丁醇作為最具潛力的新型清潔燃料之一具有熱值與汽油相當(dāng)、容易運(yùn)輸、燃燒無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)。在丁醇的各種生產(chǎn)方法中,微生物發(fā)酵法(ABE發(fā)酵)因具有環(huán)保清潔、不需要使用催化劑、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)勢(shì)而成為主要研究方法。拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii NCIMB 8052)具有底物適應(yīng)譜廣、遺傳性狀穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),是ABE發(fā)酵的常用菌株,但是,其丁醇產(chǎn)量低是一直沒(méi)有突破的瓶頸,而CoA轉(zhuǎn)移酶是啟動(dòng)梭菌溶劑合成途徑的關(guān)鍵酶,在梭菌中過(guò)表達(dá)該酶對(duì)提升梭菌的丁醇產(chǎn)量具有重要意義。因此,本文利用課題組保藏的C.beijerinckii NCIMB 8052,構(gòu)建了CoA轉(zhuǎn)移酶過(guò)表達(dá)基因工程菌,并對(duì)其進(jìn)行了發(fā)酵性能分析。主要研究結(jié)果如下:(1)構(gòu)建了CoA轉(zhuǎn)移酶過(guò)表達(dá)基因工程菌。設(shè)計(jì)了CoA轉(zhuǎn)移酶基因ctfAB特異性引物,以C.beijerinckii NCIMB 8052基因組為模板,擴(kuò)增得到了ctfAB片段,將其與pMD-19T進(jìn)行了連接,完成了T/A克隆,測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤后,將經(jīng)過(guò)Bsr GI和HindIII雙酶切的ctfAB片段和載體pMTL007進(jìn)行了連接,構(gòu)建了CoA轉(zhuǎn)移酶過(guò)表達(dá)載體pMTL007-ctfAB,并將其電轉(zhuǎn)化入C.beijerinckii NCIMB 8052中,通過(guò)菌落PCR和SDS-PAGE電泳驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),證實(shí)CoA轉(zhuǎn)移酶過(guò)表達(dá)基因工程菌構(gòu)建成功;(2)對(duì)工程菌進(jìn)行了發(fā)酵性能分析。工程菌和野生菌進(jìn)行了分批搖瓶發(fā)酵,分別對(duì)兩者的發(fā)酵液pH值、發(fā)酵液殘?zhí)橇俊⒕w生物量和溶劑產(chǎn)量進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn):工程菌提前進(jìn)入產(chǎn)溶劑期,其pH值比野生菌提前出現(xiàn)上升趨勢(shì);在發(fā)酵12-24h這一時(shí)段內(nèi),工程菌的糖消耗速率比野生菌提高15%,工程菌最終發(fā)酵液殘?zhí)橇勘纫吧档?3.3%;發(fā)酵進(jìn)行到18 h時(shí),工程菌進(jìn)入穩(wěn)定期,野生菌則繼續(xù)生長(zhǎng),生長(zhǎng)速度超過(guò)工程菌,野生菌的最大菌體生物量大于工程菌;工程菌最高丁醇產(chǎn)量達(dá)11.53±0.63 g/L,比野生菌提高4.5%,總?cè)軇┳罡弋a(chǎn)量達(dá)16.84±0.77 g/L,比野生菌提高4.2%。本研究成功構(gòu)建了C.beijerinckii NCIMB 8052的CoA轉(zhuǎn)移酶過(guò)表達(dá)基因工程菌,為在C.beijerinckii NCIMB 8052中進(jìn)一步開(kāi)展CoA轉(zhuǎn)移酶的研究提供了一種可能,也為提高ABE發(fā)酵的丁醇產(chǎn)量提供了一種途徑。
【圖文】：

圖 2-1 ctfAB 基因片段 PCR 擴(kuò)增結(jié)果Marker：DNA Marker III；泳道 2-8：ctfAB 基因片段Fig 2-1 The result of PCR amplification for ctfAB gene sequenceMarker：DNA Marker III；Lane2 to 8：ctfAB gene sequence

27 2-2 ctfAB 基因片段膠回收 III；泳道 ctfAB gene：回收l(shuí) purification of ctfAB gene seLane ctfAB gene：The purifie隆糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖帶，轉(zhuǎn)化效率較高。經(jīng)
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：TQ923;TQ223.124

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2639836