【摘要】：氨基酸脫羧酶(Amino acid decarboxylase)是一類催化氨基酸脫去羧基生成小分子氨基酸或者生物胺的裂解酶的總稱,其產(chǎn)物在生物體內(nèi)大多具有特殊的生理作用。其中L-天冬氨酸α-脫羧酶(L-aspartate alpha-decarboxylase,EC:4.1.1.11,PanD/ADC)因其能夠催化L-天冬氨酸脫去α-羧基生成β-丙氨酸而成為最受關(guān)注的氨基酸脫羧酶之一。β-丙氨酸作為重要的平臺化合物,是合成泛酸鈣、肌肽、1,4-丁二胺、丙烯酰胺等大宗化學品的前體,在生物制藥、食品、化工等領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用,具有巨大的工業(yè)價值。當前利用L-天冬氨酸α-脫羧酶和廉價原料L-天冬氨酸綠色制造β-丙氨酸已逐步成為取代傳統(tǒng)化學法的主流工藝。然而,已實現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用的L-天冬氨酸α-脫羧酶僅來源于大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌或枯草芽孢桿菌,生產(chǎn)效率極為低下,因為它們在催化過程中均表現(xiàn)出不可逆的失活現(xiàn)象(簡稱催化失活),而目前該不可逆失活的機制尚沒有被清晰解釋,是相關(guān)生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展的嚴重桎梏。本論文通過構(gòu)建L-天冬氨酸α-脫羧酶的假定蛋白文庫,獲得了大量不同來源的L-天冬氨酸α-脫羧酶資源,考察了該酶的催化失活規(guī)律。通過動力學分析,解析這一類酶催化失活的機制,并且建立了催化失活強度的表征方法;最后,從自剪切加工和催化結(jié)構(gòu)域兩個方面鑒定催化失活相關(guān)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:(1)通過構(gòu)建假定蛋白文庫,篩選獲得了53種不同來源的L-天冬氨酸α-脫羧酶基因。通過對GenBank生物信息數(shù)據(jù)庫中L-天冬氨酸α-脫羧酶編碼基因的查找和系統(tǒng)進化分析,建立了假定蛋白文庫,實現(xiàn)了其中38種重組酶在大腸桿菌系統(tǒng)中的表達與純化,進一步的酶活力測定結(jié)果表明其中33種重組酶具有L-天冬氨酸α-脫羧酶活性。通過分析文庫中重組酶催化失活情況,發(fā)現(xiàn)丙酮酰依賴型L-天冬氨酸α-脫羧酶(PYR-ADC)存在普遍的催化失活作用,然而磷酸吡哆醛依賴型L-天冬氨酸α-脫羧酶(PLP-ADC)沒有表現(xiàn)出催化失活作用。另外,通過對酶活力的調(diào)查結(jié)果顯示,目前現(xiàn)有的工業(yè)酶是低效的,文庫挖掘獲得了8個催化效率更高的酶,其中來源于Corynebacterium jeikeium的PD_(Cjei)比酶活達到11.55 U/mg,為目前報道最高。(2)通過催化失活動力學分析,發(fā)現(xiàn)了PYR-ADC催化失活的不可逆性,并且建立了催化失活強度的表征方法。通過對重組酶剩余酶活與反應(yīng)時間/底物濃度關(guān)系的測定,發(fā)現(xiàn)該酶的失活作用屬于基于機理的失活(Mechanism-based enzyme inactivation,MBEI)類型,催化過程中底物與活性中心結(jié)合破壞丙酮�；鶊F結(jié)構(gòu),造成了酶的不可逆失活。該酶在底物濃度500 mM以內(nèi)其剩余酶活的自然對數(shù)與反應(yīng)時間呈線性相關(guān),利用該線性關(guān)系對應(yīng)的失活速率(k_(obs))建立了催化失活強度的快速表征方法,從而比較文庫中不同來源重組酶的催化穩(wěn)定性強弱。(3)基于文庫鑒定了L-天冬氨酸α-脫羧酶催化失活相關(guān)自剪切機制的關(guān)鍵氨基酸。利用Tricine-SDS-PAGE分析文庫中33株P(guān)YR-ADC的電泳條帶分布,按照自剪切效率的大小將其分為三類。結(jié)合分類結(jié)果和催化活性分析,說明了自剪切加工是獲得催化功能結(jié)構(gòu)(即PYR基團)的必要步驟;結(jié)合分類結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育分析,發(fā)現(xiàn)Class I和Class III的重組酶在自剪切加工位點附近的保守氨基酸具有明顯差異:Class I的保守氨基酸序列為EGSCA而Class III的為VGSIT。進一步地,通過點突變驗證和蛋白結(jié)構(gòu)比較,發(fā)現(xiàn)自剪切位點附近的Val23、Ile26、Thr27和Glu56是影響自剪切加工的關(guān)鍵氨基酸位點。(4)基于文庫鑒定了L-天冬氨酸α-脫羧酶催化失活相關(guān)功能結(jié)構(gòu)域的關(guān)鍵氨基酸。根據(jù)文庫中不同來源的重組酶的催化穩(wěn)定性差異和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息選擇了12個突變位點,利用點飽和突變技術(shù)構(gòu)建突變文庫,利用基于比色的高通量篩選方法篩選催化活性提高的突變體,進一步動力學參數(shù)測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)氨基酸位點Arg3、Ala74和Glu42的突變對酶催化活力的提升有幫助,其中位點Arg3和Ala74是影響催化穩(wěn)定性的關(guān)鍵氨基酸位點。突變體中R3K較野生型在催化性能上有明顯提高:催化效率提升了3倍,催化穩(wěn)定性提高了66.38%。(5)針對文庫發(fā)現(xiàn)的非催化失活型PLP-ADC進行了功能鑒定及應(yīng)用分析。從數(shù)據(jù)庫中查找了6個PLP-ADC編碼基因序列,利用基因合成技術(shù)獲得了PLP-ADC的基因,并通過分別構(gòu)建含組氨酸和GST標簽的表達載體,在大腸桿菌表達系統(tǒng)中對重組酶進行了表達與純化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)來源于古細菌的3株重組酶具有良好的活性,選擇其中酶活最高的PD_(Mja)(6.87 U/mg)進行酶學性質(zhì)分析,發(fā)現(xiàn)該酶最適溫度和最適pH分別為80℃和8.0,具有很好的熱穩(wěn)定性。進一步進行酶催化轉(zhuǎn)化的研究發(fā)現(xiàn)PLP在反應(yīng)過程中與底物結(jié)合發(fā)生了降解,因此反應(yīng)過程中輔酶PLP的穩(wěn)定性和回收利用是該酶應(yīng)用上的主要限制因素。
【圖文】：

圖 1-1 L-天冬氨酸 α-脫羧酶自剪切加工過程示意圖Fig. 1-1 Schematic representation of self-processing reaction in L-aspartate alpha-decarboxylase（2）L-天冬氨酸 α-脫羧酶的促進子（PanZ）的發(fā)現(xiàn)和功能研究盡管體外 E.coli 的 PanD 在 37℃條件下孵化能加速其加工過程，獲得一定程度的活化，但是延長孵化時間，其活化速率相對于體內(nèi)還是相差很多，這說明生物體內(nèi)可能有促進原酶加工的催化劑[53]。然而，在丙酮酰依賴型脫羧酶的報道中，S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的活化能被腐胺和亞精胺激活，而組氨酸脫羧酶能被酶 HdcB 激活。因此國外學者們也開始對 PanD 的促進子（PanZ）展開了研究。Nozaki 等[53]分析了泛酸缺陷型突變體的染色體突變情況，在染色體 89min 的位置發(fā)現(xiàn)了在泛酸代謝途徑中的關(guān)鍵基因 yhhK（后也稱 panZ, panM））。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)該基因能促進 PanD 的激活，同時保守存在于大腸桿菌相關(guān)的腸道菌群中，例如 Shigella,Salmonella, Klebsiella 和 Yersinia 等。腸道菌群的泛酸含量豐富，通過 PanZ 對 PanD 的調(diào)控能有效控制 β-丙氨酸的合成，進而調(diào)控泛酸以及輔酶 A 的代謝。Stuecker 等[54]發(fā)現(xiàn)PanZ 是一種類似 Gcn5 的 N-乙酰轉(zhuǎn)移酶蛋白，它沒有乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，但是具有乙酰輔酶 A 的感應(yīng)功能，能促進 PanD 的熟化。

1-3 L-天冬氨酸 α-脫羧酶的脫羧作用及伴隨的轉(zhuǎn)氨作用推測機3 Postulated mechanisms for L-aspartate α-decarboxylase decarboxyladecarboxylation-dependent transamination（注：圖中質(zhì)子化位置用粗體 H 原子標出。）酸 α-脫羧酶分子改造研究進展 的特殊加工機制和催化特性，目前對 PanD 的研究主要注釋，，自剪切和催化機理的解析等理論研究水平，對其應(yīng)化過程中酶的穩(wěn)定性是限制其應(yīng)用的主要原因，同時由氨作用，酶的重復(fù)利用率也受到限制，因此其分子改造和催化穩(wěn)定性。是 PanD 獲得催化活性不可或缺的加工步驟。不同微生蛋白本身的分子結(jié)構(gòu)[86]，因此自加工效率是 PanD 提高文景等[87]克隆了谷氨酸棒桿菌 ST01 的 panD 基因獲得影響自剪切和活性中心的氨基酸殘基 Arg3、Lys9、Arg
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q78;TQ426.97

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本文編號：2611029