為研究甘露醇濃度、酶解時(shí)間、離心力大小和不同外植體對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響,采用正交試驗(yàn)方案對(duì)甘藍(lán)原生質(zhì)體制備體系進(jìn)行了優(yōu)化,并建立了甘藍(lán)原生質(zhì)體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系,同時(shí)利用該體系對(duì)甘藍(lán)CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明:以下胚軸為材料,酶液組成為1%纖維素酶+0.5%離析酶+0.6 mol/L甘露醇+10 mmol/L MES+1 mmol/L CaCl₂+0.1%BSA+5 mmol/Lβ-巰基乙醇,26℃,60 r/min,黑暗酶解6 h后,用2 115 r/min離心5 min收集細(xì)胞,可獲得高質(zhì)量的原生質(zhì)體,原生質(zhì)體產(chǎn)量約為3.0×10～6個(gè)/g,活力約為90.9%;另外,在20%PEG4000介導(dǎo)下,將帶有綠色熒光蛋白的載體（PYBA 1132）分別轉(zhuǎn)入從甘藍(lán)下胚軸、子葉、葉球分離獲得的原生質(zhì)體中,在熒光顯微鏡下觀察到GFP綠色熒光信號(hào),轉(zhuǎn)化效率分別為43%,35%,19%,表明下胚軸分離獲得的原生質(zhì)體最適于瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。同時(shí)以下胚軸分離獲得的原生質(zhì)體為受體,分別轉(zhuǎn)化線粒體特異表達(dá)載體COX和質(zhì)體特異表達(dá)載體969,也觀察到了熒光信號(hào)...

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圖1 甘露醇各水平的產(chǎn)量和活力均值LSD比較

進(jìn)一步對(duì)各因素各水平間的處理結(jié)果進(jìn)行LSD多重比較分析顯示,甘露醇作為滲透壓穩(wěn)定劑,過高或過低均會(huì)對(duì)原生質(zhì)體數(shù)量和活力產(chǎn)生影響,當(dāng)甘露醇濃度達(dá)到0.6mol/L時(shí),分離得到的原生質(zhì)體數(shù)量和活力均為最好,顯著高于其他2組(圖1);由圖2所示,隨著酶解時(shí)間的增加,分離得到的原生質(zhì)體....

圖2 酶解時(shí)間各水平的產(chǎn)量和活力均值LSD比較

圖1甘露醇各水平的產(chǎn)量和活力均值LSD比較2.2優(yōu)化條件下原生質(zhì)體制備

圖3 離心速度各水平的產(chǎn)量和活力均值LSD比較

通過四因素三水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),獲得了影響原生質(zhì)體制備的4個(gè)因素的最佳組合,因試驗(yàn)設(shè)計(jì)中沒有最佳組合,故對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,以甘藍(lán)下胚軸為外植體,在含有0.6mol/L甘露醇的酶解液中黑暗酶解6h,以2115r/min的離心速度收集細(xì)胞,對(duì)分離獲得的原生質(zhì)體數(shù)量和活力進(jìn)行....

圖4 外植體各水平的產(chǎn)量和活力均值LSD比較

圖3離心速度各水平的產(chǎn)量和活力均值LSD比較圖5最佳條件下分離獲得的原生質(zhì)體形態(tài)和活力

本文編號(hào)：4022307