基因組編輯技術(shù)是近幾年興起的一項(xiàng)能對基因組完成精確修飾的一種技術(shù),在2012年被Science評為十大重要科學(xué)進(jìn)展之一,在植物功能基因組學(xué)及分子設(shè)計(jì)育種上具有廣闊的應(yīng)用前景。U3和U6啟動子能驅(qū)動sgDNA的轉(zhuǎn)錄,是CRISPR-Cas9系統(tǒng)中的重要元件之一,在番茄中至少有4個U3啟動子和10個U6啟動子,這些啟動子是否都具有轉(zhuǎn)錄功能?所以從番茄中篩選出具有高效轉(zhuǎn)錄活性的啟動子從而提高CRISPR-Cas9系統(tǒng)的特異性。目前關(guān)于番茄內(nèi)源啟動子驅(qū)動sgDNA實(shí)現(xiàn)基因編輯還未見報道,并且番茄內(nèi)源啟動子與外源啟動子驅(qū)動sgRNA的CRISPR/Cas9基因編輯效率是否有所差異還不清楚。本研究開展了兩方面的工作,一方面從番茄中克隆多個候選U3和U6啟動子并進(jìn)行功能鑒定,為構(gòu)建番茄CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)提供高效的的啟動子;另一方面將篩選出具有較高轉(zhuǎn)錄活性的啟動子SlU6-2P4,構(gòu)建以SlU6-2P4為啟動子驅(qū)動sgRNA,以番茄白粉病相關(guān)基因MLO1和EDR1為靶序列的CRISPR/Cas9基因組編輯載體,并同時構(gòu)建以擬南芥AtU6及AtU6-26為啟動子的CRISPR/Cas9編...

【文章頁數(shù)】：50 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖1-1CRISPR/Cas9系統(tǒng)機(jī)制示意圖

個Cas9蛋白介導(dǎo)靶位點(diǎn)的切割，Type分子，還可以對RNA分子進(jìn)行降解菌將被病毒侵染死亡。as系統(tǒng)是僅由一個Cas9蛋白介導(dǎo)靶位個系統(tǒng)，目前已成功運(yùn)用于多種生物和crRNA形成的二級結(jié)構(gòu)，合成了一它能引導(dǎo)Cas9蛋白在基因組中特SBs），隨后誘發(fā)機(jī)體啟....

圖2-1番茄不同截短SlU3-Ps啟動子驅(qū)動GUS融合表達(dá)載體構(gòu)建Fig.2-1ConstructionofGUSreportergenefusionexpressionvectordrivenbydifferenttomatotruncated248GUSGUST-SlU3-4P5

茄基因編輯體系的建立P的質(zhì)粒，分別回收目標(biāo)片段并用T4連接酶連nⅠ進(jìn)行酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒命名為SlU3∷GV3101，于28℃倒置培養(yǎng)兩天，挑取陽性克隆25μg·mL－1）進(jìn)行搖菌，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后提取確后置于-80℃保存鑒定正確的農(nóng)桿菌菌液和00融合表....

圖2-2番茄U3啟動子第一輪PCR擴(kuò)增Fig.2-2ThefirstroundofPCRamplificationoftomatoU3promoters

水漂洗染色后的葉片4~5次以除去殘留進(jìn)行脫色處理，脫色時每3~4小時更換一SlU3-3P、SlU3-4P啟動子第1輪擴(kuò)增產(chǎn)功擴(kuò)增出SlU3-1P、SlU3-3P、SlU3-4啟7bp。用BglII和NotI雙酶切鑒定SlU3P重組質(zhì)粒，Nsi....

圖2-33種番茄U3啟動子的TransferPCR擴(kuò)增及酶切鑒定500bp590bp420bp622bp661bp629bp420bp

D種番茄U3啟動子的TransferPCRplificationandidentificationofthreeM：2kbPlusIIDNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；5f；C：T-SlU3-4P4f；2：T-SlU3-啟動子片段，目的大片段為第二階tion;M:....

本文編號：3967563