CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9)系統(tǒng)作為一種新的基因編輯工具,其操作簡單、成本低、周期短,正在被廣泛研究和應(yīng)用,目前已經(jīng)成功實現(xiàn)了在水稻、小麥、擬南芥、本生煙草、蘋果、香蕉、小鼠等生物中的基因定點編輯。近兩年CRISPR系統(tǒng)在葡萄上也得到了成功的應(yīng)用,但尚不成熟。本試驗利用CRISPR/Cas9技術(shù)對‘無核白’葡萄(Vitis vinifera cv.Thompson Seedless)的VvOEE2基因和VvPDS1基因進行定點敲除,以期望獲得基因編輯的‘無核白’葡萄植株。主要結(jié)果如下:1.利用雙子葉植物基因編輯載體pP1C.4和pYLCRISPR/Cas9成功構(gòu)建重組質(zhì)粒:pP1C.4-OEE2-2、pP1C.4-PDS1-1、pP1C.4-PDS1-2、pYL-OEE2-15,利用這四個重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化‘無核白’葡萄體細胞胚,經(jīng)過篩選培養(yǎng),依次獲得80、0、63、13株抗性植株,通過對抗性植株的靶序列測序分析,并未檢測到靶點的突變。2.利用基因編輯載體pJim19...

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1.1 基因編輯技術(shù)
    1.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)
        1.2.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)
        1.2.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用方式
        1.2.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究歷史
        1.2.4 CRISRP/Cas系統(tǒng)的應(yīng)用
    1.3 目的基因的生物學(xué)功能
        1.3.1 OEE2(oxygen-evolving enhancer protein2)基因
        1.3.2 PDS(phytoene dehydrogenase)基因
    1.4 研究的目的和意義
第二章 利用pP1C.4、pYLCRISPR/Cas9載體構(gòu)建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化無核白葡萄體細胞胚及鑒定
    2.1 試驗材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株與載體
        2.1.3 試驗試劑及其配置
        2.1.4 儀器設(shè)備
    2.2 試驗方法
        2.2.1 VvOEE2和VvPDS1基因靶序列的擴增與比對
        2.2.2 構(gòu)建重組質(zhì)粒載體
        2.2.3 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化
        2.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)葡萄體細胞胚的遺傳轉(zhuǎn)化
        2.2.5 陽性植株的鑒定檢測
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 VvOEE2基因、VvPDS1基因靶序列的擴增
        2.3.2 靶序列的比對
        2.3.3 sgRNA靶點選擇以及引物設(shè)計
        2.3.4 利用載體一pP1C.4構(gòu)建重組質(zhì)粒載體
        2.3.5 利用載體二pYLCRISPR/Cas9構(gòu)建重組質(zhì)粒載體
        2.3.6 轉(zhuǎn)化葡萄植株的檢測
    2.4 討論
第三章 利用pCambia1300、pJim19載體構(gòu)建重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)化‘無核白’葡萄及鑒定
    3.1 試驗材料
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 菌株與載體
        3.1.3 試驗試劑及其配置
        3.1.4 儀器設(shè)備
    3.2 試驗方法
        3.2.1 構(gòu)建重組質(zhì)粒載體
        3.2.2 瞬時轉(zhuǎn)化葡萄原生質(zhì)體
        3.2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葡萄葉片瞬時轉(zhuǎn)化
        3.2.4 瞬時轉(zhuǎn)化葡萄的檢測
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 靶點的選擇和引物設(shè)計
        3.3.2 酶切pAtU6-M載體
        3.3.3 雙酶切載體pCambia1300、pJim19與pAtU6-sgRNAs連接
        3.3.4 質(zhì)粒測序結(jié)果
        3.3.5 葡萄原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化
        3.3.6 葡萄葉片瞬時轉(zhuǎn)化
    3.4 討論
第四章 結(jié)論
參考文獻
致謝
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本文編號：3920984