發(fā)布時間：2023-03-05 11:50

　　糙皮側耳作為一種大型木腐真菌,通過分泌漆酶來降解培養(yǎng)料中的木質素。在糙皮側耳基因組中共有12條假定的漆酶編碼基因,其中,poxc(lacc10)基因的編碼產物是一種典型的糙皮側耳漆酶,并且其表達量在糙皮側耳整個生長發(fā)育過程中均很高。ltf4是通過應用酵母單雜交技術,利用糙皮側耳poxc核心啟動子序列構建誘餌菌株,從子實體cDNA文庫中得到的基因。本文以糙皮側耳新831菌株作為研究對象,對ltf4基因進行了如下研究:擴增ltf4基因的CDS區(qū)并對其進行生物信息學分析;利用反轉錄PCR(RT-PCR)對ltf4和poxc基因進行表達模式分析;對ltf4基因進行原核異源表達及蛋白純化;利用凝膠阻滯實驗(EMSA)檢測LTF4與poxc核心啟動子序列的互作情況;構建ltf4基因的過表達和反義沉默載體,為ltf4基因功能的體內分析做準備。本文主要結論如下:1、以糙皮側耳子實體期cDNA為模板進行PCR,成功克隆得到了糙皮側耳ltf4基因的CDS區(qū),ltf4基因CDS區(qū)長1,608 bp,編碼產物長535 aa。生物信息學分析結果顯示:LTF4與糙皮側耳PC15中某假定蛋白(KDQ29010.1)...

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
第一章 文獻綜述
    1.1 糙皮側耳漆酶
        1.1.1 糙皮側耳漆酶的酶學性質
        1.1.2 糙皮側耳漆酶的基因表達
    1.2 真菌轉錄因子研究
        1.2.1 轉錄因子結構
        1.2.2 轉錄因子的研究方法
            1.2.2.1 凝膠阻滯
            1.2.2.2 DNase I足跡法
            1.2.2.3 染色質免疫共沉淀技術
    1.3 基因功能的研究方法
        1.3.1 基因敲除
        1.3.2 RNA干擾
        1.3.3 反義RNA技術
        1.3.4 超表達
第二章 引言
    2.1 研究依據(jù)及意義
    2.2 實驗技術路線
第三章 糙皮側耳ltf4 基因的克隆及生物信息學分析
    3.1 實驗材料
        3.1.1 菌株和載體
        3.1.2 培養(yǎng)基
        3.1.3 主要試劑
        3.1.4 儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 糙皮側耳子實體期總RNA提取
            3.2.1.1 利用Trizol試劑提取糙皮側耳總RNA
            3.2.1.2 總RNA質量檢測方法
        3.2.2 cDNA第一條鏈的合成
        3.2.3 糙皮側耳ltf4基因全長CDS區(qū)的擴增
        3.2.4 目的產物的回收純化
        3.2.5 目的基因連接T載體
            3.2.5.1 目的基因3’端加“A”
            3.2.5.2 目的基因與T載體連接
        3.2.6 連接產物轉化感受態(tài)細胞
            3.2.6.1 E.coli DH5α感受態(tài)細胞的制備
            3.2.6.2 轉化感受態(tài)細胞
        3.2.7 篩選陽性轉化子
        3.2.8 糙皮側耳ltf4 基因生物信息學分析
    3.3 結果與分析
        3.3.1 糙皮側耳ltf4 基因全長CDS區(qū)的擴增
            3.3.1.1 ltf4 基因比對結果
            3.3.1.2 糙皮側耳子實體期總RNA提取及c DNA合成
            3.3.1.3 擴增糙皮側耳ltf4基因的全長CDS區(qū)
            3.3.1.4 ltf4 基因CDS區(qū)測序及分析
        3.3.2 糙皮側耳LTF4 功能預測及結構分析
    3.4 本章小結
第四章 ltf4 基因的原核表達及蛋白純化
    4.1 實驗材料
        4.1.1 菌株和質粒
        4.1.2 培養(yǎng)基
        4.1.3 主要試劑
        4.1.4 儀器
        4.1.5 溶液配制
    4.2 實驗方法
        4.2.1 原核表達載體pEASY-E2-ltf4 的構建
            4.2.1.1 PCR產物與pEASY-E2 表達載體連接
            4.2.1.2 連接產物轉化E.coli DH5α感受態(tài)細胞
            4.2.1.3 陽性克隆的檢測
        4.2.2 原核表達載體pEASY-E2-ltf4 轉化E.coli Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞
        4.2.3 ltf4 基因的誘導表達
            4.2.3.1 菌落PCR鑒定陽性轉化子
            4.2.3.2 誘導表達
            4.2.3.3 SDS-PAGE檢測
        4.2.4 蛋白純化
        4.2.5 目的蛋白的濃縮
    4.3 實驗結果
        4.3.1 原核表達載體pEASY-E2-ltf4 的構建
        4.3.2 原核表達及SDS-PAGE分析
        4.3.3 蛋白純化及濃縮
    4.4 本章小結
第五章 糙皮側耳漆酶基因poxc及其轉錄因子基因ltf4 的表達模式分析
    5.1 實驗材料
        5.1.1 菌株
        5.1.2 培養(yǎng)基
        5.1.3 主要試劑
        5.1.4 主要儀器
    5.2 實驗方法
        5.2.1 糙皮側耳的栽培
        5.2.2 提取糙皮側耳不同生長時期的總RNA
        5.2.3 cDNA第一條鏈的合成
        5.2.4 半定量RT-PCR
            5.2.4.1 設計引物
            5.2.4.2 PCR擴增
    5.3 實驗結果
        5.3.1 糙皮側耳漆酶基因poxc表達模式分析
        5.3.2 糙皮側耳ltf4 基因表達模式分析
    5.4 本章小結
第六章 LTF4 與漆酶基因poxc核心啟動子區(qū)的體外互作研究
    6.1 實驗材料
        6.1.1 菌株與質粒
        6.1.2 培養(yǎng)基
        6.1.3 主要試劑
        6.1.4 儀器
        6.1.5 溶液配制
    6.2 實驗方法
        6.2.1 探針的擴增
            6.2.1.1 提取糙皮側耳新831 基因組DNA
            6.2.1.2 PCR擴增糙皮側耳漆酶poxc核心啟動子區(qū)域
            6.2.1.3 PCR產物的純化p MD19-T simple載體連接
            6.2.1.4 連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞
            6.2.1.5 陽性克隆的篩選與鑒定
            6.2.1.6 測序結果分析
        6.2.2 雙鏈探針的標記
            6.2.2.1 陽性質粒的酶切
            6.2.2.2 待標記探針的純化
            6.2.2.3 DIG標記雙鏈探針
            6.2.2.4 已標探針的純化
            6.2.2.5 已標探針的效率檢測
        6.2.3 結合反應
        6.2.4 電泳
        6.2.5 轉膜
        6.2.6 免疫檢測
    6.3 實驗結果
        6.3.1 糙皮側耳漆酶基因poxc核心啟動子區(qū)域的擴增
        6.3.2 陽性克隆的篩選
        6.3.3 pMD19-T Simple-poxc407 質粒的酶切及poxc407 片段的回收
        6.3.4 DIG標記雙鏈探針的純化
        6.3.5 已標探針的效率檢測
        6.3.6 凝膠阻滯實驗
    6.4 本章小結
第七章 糙皮側耳ltf4 基因過表達載體和反義沉默載體的構建
    7.1 實驗材料
        7.1.1 菌株和質粒
        7.1.2 培養(yǎng)基
        7.1.3 主要試劑
        7.1.4 儀器
    7.2 實驗方法
        7.2.1 真核表達載體構建方法與策略
        7.2.2 糙皮側耳基因ltf4 過表達與反義沉默片段的克隆
            7.2.2.1 引物設計
            7.2.2.2 ltf4-XbaI片段的PCR擴增
        7.2.3 ltf4-Xba I片段TA克隆
            7.2.3.1 ltf4-XbaI片段3’端加“A”
            7.2.3.2 ltf4-XbaI片段與p MD19-Tsimple載體連接
        7.2.4 連接產物轉化感受態(tài)細胞
        7.2.5 陽性轉化子的篩選
        7.2.6 糙皮側耳過表達與反義沉默表達載體的構建
            7.2.6.1 pMD19-T-ltf4-XbaI重組質粒與p Po-GPD表達載體的酶切、酶連
            7.2.6.2 連接產物轉化感受態(tài)細胞
            7.2.6.3 陽性克隆的篩選與鑒定
            7.2.6.4 測序結果分析
    7.3 結果與分析
        7.3.1 糙皮側耳ltf4-XbaI片段的克隆
        7.3.2 糙皮側耳ltf4 過表達與反義沉默載體的構建
    7.4 本章小結
第八章 農桿菌介導真核表達載體轉化糙皮側耳
    8.1 實驗材料
        8.1.1 菌種和質粒
        8.1.2 培養(yǎng)基
        8.1.3 主要試劑
        8.1.4 儀器
        8.1.5 溶液配制
    8.2 實驗方法
        8.2.1 過表達及反義沉默載體轉化農桿菌EHA105
        8.2.2 篩選陽性轉化子
        8.2.3 過表達及反義沉默載體轉化糙皮側耳
            8.2.3.1 糙皮側耳潮霉素致死濃度的探究
            8.2.3.2 糙皮側耳菌絲塊的培養(yǎng)
            8.2.3.3 農桿菌的培養(yǎng)
            8.2.3.4 農桿菌與糙皮側耳共培養(yǎng)
            8.2.3.5 糙皮側耳轉化子的初篩與復篩
    8.3 結果與分析
        8.3.1 過表達及反義沉默載體轉化農桿菌EHA105
        8.3.2 糙皮側耳潮霉素致死濃度的探究
        8.3.3 糙皮側耳轉化子的初篩與復篩
    8.4 本章小結
第九章 結論與討論
    9.1 主要結論
    9.2 討論
    9.3 后續(xù)實驗設想
參考文獻
英文摘要



本文編號：3756140