增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)作為一種真核生物中廣泛存在的蛋白質(zhì),通過其特殊的三級結(jié)構(gòu),與DNA結(jié)合并且募集相應(yīng)的蛋白,參與DNA復(fù)制、DNA修復(fù)以及細(xì)胞周期等多種過程。羽衣甘藍(lán)(Brassica oleracea var. acephala)屬于十字花科蕓薹屬,具有較強(qiáng)的耐寒性和觀賞性,是秋冬季節(jié)城市綠化的重要景觀植物。本研究以羽衣甘藍(lán)S13-bS13-b自交不親和系為研究材料,分離羽衣甘藍(lán)PCNA1和PCNA2基因全長并進(jìn)行序列分析；利用Gateway技術(shù)構(gòu)建帶有GFP標(biāo)簽的表達(dá)載體,進(jìn)行PCNA亞細(xì)胞定位研究；通過構(gòu)建原核表達(dá)載體,原核表達(dá)純化獲得PCNA蛋白,免疫小鼠制備多克隆抗體；對羽衣甘藍(lán)不同組織及不同發(fā)育階段的柱頭進(jìn)行蛋白檢測,分析PCNA蛋白表達(dá)的時(shí)空性。這些研究為PCNA的生物學(xué)功能研究奠定了基礎(chǔ)。主要的研究結(jié)果如下：1、通過RT-PCR和RACE克隆技術(shù)從羽衣甘藍(lán)柱頭中分離得到了PCNA1和PCNA2基因。PCNA1基因全長為1127bp,其中包含5’非翻譯區(qū)126bp,3’非翻譯區(qū)209bp,開放...

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 緒論
    1.1 PCNA的簡介
    1.2 PCNA的結(jié)構(gòu)
    1.3 PCNA的表達(dá)調(diào)控
    1.4 PCNA參與DNA復(fù)制
    1.5 PCNA參與DNA修復(fù)
    1.6 PCNA參與細(xì)胞周期
    1.7 研究的目的與意義
2 PCNA基因的克隆及序列分析
    2.1 材料
        2.1.1 主要試驗(yàn)儀器
        2.1.2 主要試驗(yàn)試劑
        2.1.3 試驗(yàn)試劑配制
    2.2 方法
        2.2.1 柱頭總RNA提取
        2.2.2 PCNA基因的RT-PCR
        2.2.3 RACE克隆
        2.2.4 生物信息學(xué)分析
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 柱頭總RNA的提取
        2.3.2 PCNA基因RT-PCR
        2.3.3 PCNA的RACE克隆
        2.3.4 生物信息學(xué)分析
    2.4 討論
    2.5 本章小結(jié)
3 PCNA表達(dá)載體構(gòu)建及亞細(xì)胞定位
    3.1 材料
        3.1.1 主要試驗(yàn)試劑
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑配制
    3.2 方法
        3.2.1 轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建
        3.2.2 原生質(zhì)體亞細(xì)胞定位
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建
        3.3.2 原生質(zhì)亞細(xì)胞定位
    3.4 討論
    3.5 本章小結(jié)
4 PCNA原核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白表達(dá)純化
    4.1 材料
        4.1.1 試驗(yàn)試劑配制
    4.2 方法
        4.2.1 原核表達(dá)純化
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 PCNA原核表達(dá)純化
    4.4 討論
    4.5 本章小結(jié)
5 PCNA多克隆抗體制備及蛋白表達(dá)分析
    5.1 材料
        5.1.1 主要試驗(yàn)試劑及儀器
        5.1.2 試驗(yàn)試劑配制
    5.2 方法
        5.2.1 PCNA免疫抗體制備
        5.2.2 蛋白樣品制備
        5.2.3 SDS-PAGE電泳
        5.2.4 轉(zhuǎn)膜
        5.2.5 免疫印跡反應(yīng)
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 抗體效價(jià)檢測
        5.3.2 蛋白樣品制備
        5.3.3 PCNA在組織中表達(dá)情況檢測
        5.3.4 PCNA在不同發(fā)育時(shí)期的柱頭表達(dá)情況檢測
    5.4 討論
    5.5 本章小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝



本文編號：3738454