發(fā)布時間：2023-01-08 16:14

　　在我國冬、春季節(jié)設(shè)施生產(chǎn)過程中,番茄在不同生育時期都有可能遭受低溫弱光脅迫的傷害,從而使其生長發(fā)育與器官建成受到影響,最終導致番茄的品質(zhì)和產(chǎn)量下降。而大量的研究結(jié)果表明,油菜素內(nèi)酯能夠明顯地提高番茄植株對低溫弱光的抵抗力。因此,研究油菜素內(nèi)酯如何提高番茄植株耐低溫弱光的生理生化機制是非常重要的。本文以在生產(chǎn)上對低溫弱光耐性有較大差異的兩個番茄品種（‘中雜9號’為抗逆性較強的品種,‘中蔬4號’為抗逆性較弱的品種）為試驗材料,用人工氣候室模擬低溫（12℃/6℃,白天/黑夜）和弱光（80μmol·m-2·s-1）脅迫,結(jié)合外源施用0.1 m M的24-表油菜素內(nèi)酯（EBR）,研究了EBR對低溫弱光脅迫條件下番茄幼苗的抗氧化酶的活性,光合特性和葉綠素熒光特性的影響。同時,對抗逆蛋白進行篩選,并對篩選出的蛋白通過基因工程的方法對其進行低溫條件下的功能驗證,以期初步揭示出提高番茄幼苗耐低溫弱光脅迫的生理和生化方面的機制。研究結(jié)果如下:1.低溫弱光脅迫處理后,番茄幼苗葉片的超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,過氧化氫酶（CAT）的活性則一直降低。同時,丙二醛... 

【文章頁數(shù)】：99 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1.1 引言
    1.2 低溫和弱光脅迫分別對植物的影響
        1.2.1 低溫對植物的影響
        1.2.2 弱光對植物的影響
    1.3 油菜素內(nèi)酯提高植物抵抗低溫和弱光性的研究進展
        1.3.1 油菜素內(nèi)酯與保護酶
        1.3.2 油菜素內(nèi)酯與脯氨酸和可溶性糖
        1.3.3 油菜素內(nèi)酯與植物營養(yǎng)生長的影響
        1.3.4 油菜素內(nèi)酯與光合作用
        1.3.5 油菜素內(nèi)酯與能量代謝的關(guān)系
    1.4 ATP合成酶
        1.4.1 ATP合成酶的結(jié)構(gòu)
        1.4.2 ATP合成酶的作用機理
    1.5 蛋白質(zhì)組學技術(shù)
        1.5.1 蛋白質(zhì)分離技術(shù)-雙向電泳
        1.5.2 目的蛋白點的篩選-蛋白質(zhì)印跡
        1.5.3 蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)-質(zhì)譜技術(shù)
        1.5.4 樣品的分析-蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測
    1.6 基因工程技術(shù)
        1.6.1 植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基本路線
        1.6.2 植物基因轉(zhuǎn)化的方法
        1.6.3 轉(zhuǎn)基因植物的檢測方法
    1.7 本研究的目的意義和主要內(nèi)容
        1.7.1 研究目的及意義
        1.7.2 主要研究內(nèi)容
    1.8 技術(shù)路線
第二章 24-表油菜素內(nèi)酯對低溫弱光脅迫下番茄幼苗抗氧化酶系統(tǒng)和光合熒光特性的影響
    2.1 材料與方法
        2.1.1 供試品種
        2.1.2 材料培養(yǎng)及其處理
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 主要儀器
    2.2 試驗方法
        2.2.1 抗氧化酶的提取
        2.2.2 SOD活性的測定
        2.2.3 POD活性的測定
        2.2.4 CAT活性的測定
        2.2.5 MDA含量的測定
        2.2.6 O_2~(·-)產(chǎn)生速率的測定
        2.2.7 H_2O_2含量的測定
        2.2.8 光合參數(shù)的測定
        2.2.9 葉綠素熒光參數(shù)的測定
    2.3.結(jié)果分析
        2.3.1 EBR對SOD活性的影響
        2.3.2 EBR對POD活性的影響
        2.3.3 EBR對CAT活性的影響
        2.3.4 EBR對MDA含量的影響
        2.3.5 EBR對O_2~(·-)產(chǎn)生速率的影響
        2.3.6 EBR對H_2O_2含量的影響
        2.3.7 EBR對光合特性的影響
        2.3.8 EBR對熒光參數(shù)的影響
    2.4 討論
        2.4.1 EBR對抗氧化酶和ROS的影響
        2.4.2 EBR對光合和熒光特性的影響
    2.5 小結(jié)
第三章 24-表油菜素內(nèi)酯對低溫弱光脅迫下番茄幼苗ATP合成酶 β 亞基的影響
    3.1 材料與處理
        3.1.1 供試品種
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器
        3.1.4 材料培養(yǎng)及處理
    3.2 試驗方法
        3.2.1 可溶性總蛋白的提取
        3.2.2 SDS-PAGE電泳
        3.2.3 電洗脫法純化蛋白質(zhì)
        3.2.4 目標蛋白含量的灰度分析
        3.2.5 串聯(lián)二級質(zhì)譜
        3.2.6 ATP合成酶 β 亞基的生物信息學研究
    3.3 結(jié)果分析
        3.3.1 SDS-PAGE電泳及目標蛋白含量測定結(jié)果
        3.3.2 灰度法測定目標蛋白含量結(jié)果
        3.3.3 串聯(lián)二級質(zhì)譜結(jié)果
        3.3.4 ATP合成酶 β 亞基的結(jié)構(gòu)和功能分析
        3.3.5 ATP合成酶 β 亞基的進化分析
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 ATP合成酶 β 亞基過表達載體的構(gòu)建
    4.1 材料與方法
        4.1.1 供試品種
        4.1.2 材料培養(yǎng)及處理
        4.1.3 主要試劑及溶液的配制
        4.1.4 主要儀器
    4.2 試驗方法及步驟
        4.2.1 引物設(shè)計
        4.2.2 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄
        4.2.3 PCR反應(yīng)
        4.2.4 膠回收
        4.2.5 DNA加A反應(yīng)
        4.2.6 目的基因與T載體的連接和轉(zhuǎn)化
        4.2.7 菌落PCR檢測
        4.2.8 質(zhì)粒的提取及質(zhì)粒PCR檢測
        4.2.9 目的基因的雙酶切及膠回收
        4.2.10 目的片段和表達載體的連接和轉(zhuǎn)化
        4.2.11 菌落PCR和質(zhì)粒PCR檢測及雙酶切鑒定
    4.3 結(jié)果分析
        4.3.1 RNA的提取結(jié)果
        4.3.2 cDNA的合成和RT-PCR擴增結(jié)果
        4.3.3 目的片段膠回收結(jié)果
        4.3.4 ATP合成酶 β 亞基基因的TA克隆
        4.3.5 菌落PCR結(jié)果
        4.3.6 重組質(zhì)粒PCR結(jié)果
        4.3.7 ATP合成酶 β 亞基基因測序結(jié)果
        4.3.8 ATP合成酶 β 亞基基因和表達載體的雙酶切
        4.3.9 ATP合成酶 β 亞基基因和表達載體的膠回收
        4.3.10 ATP合成酶 β 亞基基因與表達載體的連接
        4.3.11 菌落PCR結(jié)果
        4.3.12 重組質(zhì)粒PCR結(jié)果
        4.3.13 ATP合成酶 β 亞基基因與表達載體連接的雙酶切檢測
        4.3.14 ATP合成酶 β 亞基基因全長的獲得及比對
    4.4 討論
        4.4.1 番茄幼苗葉片ATP合成酶 β 亞基基因的克隆與序列分析
        4.4.2 番茄幼苗葉片ATP合成酶 β 亞基基因過表達載體的構(gòu)建
    4.5 小結(jié)
第五章 ATP合成酶 β 亞基過表達增強了番茄幼苗抵御低溫脅迫的能力
    5.1 材料與方法
        5.1.1 供試品種
        5.1.2 主要試劑及溶液
    5.2 試驗方法及步驟
        5.2.1 制備農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞
        5.2.2 植物的表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞
        5.2.3 重組質(zhì)粒的PCR檢測
        5.2.4 轉(zhuǎn)基因番茄植株的獲得
        5.2.5 轉(zhuǎn)基因番茄潮霉素抗性基因 PCR 檢測
        5.2.6 轉(zhuǎn)基因番茄GFP基因的PCR檢測
        5.2.7 激光共聚焦檢測轉(zhuǎn)基因植株
        5.2.8 轉(zhuǎn)基因及野生型番茄幼苗的低溫處理
        5.2.9 轉(zhuǎn)基因與野生型番茄葉片中抗氧化酶和ROS含量的測定
        5.2.10 轉(zhuǎn)基因與野生型番茄葉片葉綠素含量的測定
        5.2.11 轉(zhuǎn)基因與野生型番茄葉片光合指標的測定
        5.2.12 轉(zhuǎn)基因與野生型番茄葉片葉綠素熒光參數(shù)的測定
        5.2.13 轉(zhuǎn)基因與野生型番茄葉片ATP含量的測定
    5.3 結(jié)果分析
        5.3.1 根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化及鑒定
        5.3.2 番茄的轉(zhuǎn)基因過程
        5.3.3 轉(zhuǎn)基因植物的分子檢測
        5.3.4 共聚焦番茄檢測轉(zhuǎn)基因植株的結(jié)果
        5.3.5 低溫脅迫對轉(zhuǎn)基因植株抗氧化酶活性的影響
        5.3.6 低溫脅迫對轉(zhuǎn)基因植株葉綠素含量的影響
        5.3.7 低溫脅迫對轉(zhuǎn)基因植株光合特性的影響
        5.3.8 低溫脅迫對轉(zhuǎn)基因植株熒光參數(shù)的影響
        5.3.9 低溫脅迫對轉(zhuǎn)基因植株ATP含量的影響
    5.4 討論
        5.4.1 低溫對轉(zhuǎn)基因番茄葉片抗氧化系統(tǒng)的影響
        5.4.2 低溫對轉(zhuǎn)基因番茄葉片葉綠素含量的影響
        5.4.3 低溫對轉(zhuǎn)基因番茄葉片光合及熒光特性的影響
        5.4.4 低溫對轉(zhuǎn)基因番茄葉片ATP含量的影響
    5.5 小結(jié)
第六章 結(jié)論與創(chuàng)新點
    6.1 結(jié)論
    6.2 主要創(chuàng)新點
參考文獻
附圖
縮略詞
致謝
作者簡介


【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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本文編號：3728788