發(fā)布時間：2022-12-07 03:42

　　柑橘黃龍�。–itrusHuanglongbing,HLB）是全球范圍內(nèi)柑橘產(chǎn)業(yè)上威脅最大的病害之一,其病原為韌皮部限制性難培養(yǎng)革蘭氏陰性菌。外膜蛋白在許多革蘭氏陰性菌的致病過程中起重要作用。本課題在我們實驗室前期研究的基礎(chǔ)上,對具有激發(fā)子功能的MotB外膜蛋白基因進(jìn)行進(jìn)一步的研究,明確該基因在本氏煙和大腸桿菌中的亞細(xì)胞定位及表達(dá)特性,取得的主要研究成果如下:1.MotB外膜蛋白基因及其缺失跨膜結(jié)構(gòu)域△tMotB基因在本氏煙（Nicotiana benthamian）中亞細(xì)胞定位:采用Gateway技術(shù)分別將目的基因（MotB,△tMotB）構(gòu)建至入門載體pDONRrM/Zeo及植物表達(dá)載體pMW390中,采用農(nóng)桿菌浸潤注射接種本氏煙的葉片背面,于接種后48-72 h激光共聚焦觀察熒光,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MotB外膜蛋白基因及其缺失跨膜結(jié)構(gòu)域△tMotB基因均在本氏煙的細(xì)胞核和胞質(zhì)處有熒光信號。2.MotB及△tMotB基因引起的本氏煙中10個HR標(biāo)志基因的表達(dá)情況:采用熒光定量 PCR 分析結(jié)果表明,SIPK、WIPK、BAK1、RbohB、TOBPAL、ACRE31 基因均基本表現(xiàn)相同趨勢,... 

【文章頁數(shù)】：79 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表(Abbreviation)
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 柑橘黃龍病發(fā)生與危害
    1.2 HLB病菌
        1.2.1 分類地位及遺傳多樣性研究
        1.2.2 基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及致病機(jī)理
    1.3 外膜蛋白研究進(jìn)展
        1.3.1 OMPs的結(jié)構(gòu)和功能
        1.3.2 肽聚糖相關(guān)脂蛋白
    1.4 亞細(xì)胞定位
    1.5 植物抗病反應(yīng)的信號通路
        1.5.1 植物的先天性免疫系統(tǒng)
        1.5.2 免疫反應(yīng)信號通路
    1.6 研究目的及意義
第二章 CaLas外膜蛋白基因MotB及△tMotB在本氏煙中的亞細(xì)胞定位及表達(dá)分析
    2.1 材料與方法
        2.1.1 試驗材料
        2.1.2 主要供試菌株和質(zhì)粒
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 目的基因引物設(shè)計及擴(kuò)增
        2.1.5 DNA片段的回收與純化
        2.1.6 Gateway技術(shù)BP反應(yīng)及LR反應(yīng)
        2.1.7 質(zhì)粒的小量提取
        2.1.8 根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)的制備
        2.1.9 熱擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101菌株及陽性鑒定
        2.1.10 根癌農(nóng)桿菌誘導(dǎo)接種本氏煙及瞬時表達(dá)
        2.1.11 樣品采集
        2.1.12 植物總RNA的提取
        2.1.13 DNA消化
        2.1.14 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
        2.1.15 qRT-PCR的擴(kuò)增
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 入門載體的構(gòu)建
        2.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建及目的基因序列分析
        2.2.3 重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌陽性鑒定
        2.2.4 MotB及△tMotB基因引起的本氏煙表型
        2.2.5 MotB及△tMotB基因在本氏煙中的亞細(xì)胞定位
        2.2.6 MotB與△ tMotB基因引起的防衛(wèi)相關(guān)基因表達(dá)分析
    2.3 小結(jié)與討論
第三章 CaLas外膜蛋白基因原核表達(dá)及多克隆抗體的制備
    3.1 材料與方法
        3.1.1 主要供試菌株、質(zhì)粒
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 目的基因引物設(shè)計及PCR擴(kuò)增
        3.1.4 MotB基因蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測
        3.1.5 目的片段TA克隆
        3.1.6 E.coli感受態(tài)細(xì)胞的制備
        3.1.7 熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌及陽性轉(zhuǎn)化子的鑒定
        3.1.8 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.1.9 目的基因的原核誘導(dǎo)表達(dá)
        3.1.10 SDS-PAGE檢測
        3.1.11 誘導(dǎo)表達(dá)蛋白可溶性分析
        3.1.12 Western blot分析
        3.1.13 目標(biāo)蛋白的純化
        3.1.14 多克隆抗體的制備
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 MotB基因蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測
        3.2.2 MotB基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.2.3 MotB基因原核表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)及條件篩選
        3.2.4 MotB基因原核表達(dá)產(chǎn)物的Western blot分析
        3.2.5 重組蛋白的純化及多克隆抗體效價
    3.3 小結(jié)與討論
第四章 CaLas外膜蛋白在E.coli中定位及泌出性分析
    4.1 材料與方法
        4.1.1 主要試劑、載體及儀器
        4.1.2 引物設(shè)計
        4.1.3 基因的擴(kuò)增
        4.1.4 目的基因和目的載體的處理
        4.1.5 構(gòu)建含有GFP的重組載體
        4.1.6 目的基因MotB及△tMotB在E.coli中誘導(dǎo)表達(dá)
        4.1.7 目的基因蛋白MotB在大腸桿菌中的泌出性分析
        4.1.8 目的基因蛋白MotB及△tMotB在大腸桿菌中的定位
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 MotB及△tMotB基因原核定位載體的構(gòu)建
        4.3.2 MotB-1GFP及△tMotB-1GFP重組載體在E.coli中誘導(dǎo)表達(dá)
        4.3.3 MotB蛋白在E.coli中泌出性分析
        4.3.4 MotB及△tMotB蛋白在大腸桿菌中定位
    4.4 小結(jié)與討論
第五章 結(jié)論與展望
參考文獻(xiàn)
附錄1: pMD 18-T載體信息
附錄2: pET-22b(+)載體圖譜及多克隆位點(diǎn)信息
附錄3: pET-28a(+)與pET-28b(+)載體圖譜及多克隆位點(diǎn)信息
附錄4: pET His6 GFP TEV LIC cloning vector (1GFP)載體圖譜及信息
附錄5: 主要試劑及溶液的配置
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]柑桔黃龍病及其控防對策[J]. 何源委,伍興甲,何懿平.  湖南農(nóng)業(yè)科學(xué). 2015(01)
[2]蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位的生物信息學(xué)研究[J]. 張松,黃波,夏學(xué)峰,孫之榮.  生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展. 2007(06)
[3]信號肽及其在蛋白質(zhì)表達(dá)中的應(yīng)用[J]. 韋雪芳,王冬梅,劉思,周鵬.  生物技術(shù)通報. 2006(06)
[4]柑桔黃龍病對青霉素和四環(huán)素的反應(yīng)[J]. 趙學(xué)源,邱柱石,蘇維芳,蔣元暉.  中國柑桔. 1981(04)



本文編號：3712169