CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)在植物功能基因組學(xué)和植物分子育種研究中展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景,已應(yīng)用于多種植物。目前該體系已在蘋果（Malus×domestica）中實現(xiàn)基因編輯但進展較緩慢。U6啟動子是CRISPR/Cas9基因組編輯載體中驅(qū)動sgRNA轉(zhuǎn)錄的重要元件,其轉(zhuǎn)錄活性受親緣關(guān)系和序列長度的影響。因此,篩選出合適的蘋果內(nèi)源U6啟動子,將進一步優(yōu)化蘋果CRISPR/Cas9基因編輯體系�！鸸凇O果基因組中存在多條U6 snRNA,本研究選擇E-value＜3e^-40的6條U6 snRNA,取其轉(zhuǎn)錄起始位點上游1 500 bp外加27 bp snRNA序列作為候選U6啟動子進行比對分析。而后設(shè)計引物克隆并構(gòu)建U6啟動子驅(qū)動螢火蟲熒光素酶基因（Firefly luciferase,LUC）的融合表達載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化法分別轉(zhuǎn)染蘋果愈傷組織和本氏煙草（Nicotiana benthamiana）葉片,通過檢測熒光素酶活性對各候選U6啟動子進行轉(zhuǎn)錄活性比較。篩選到一條轉(zhuǎn)錄活性最高的U6啟動子后,對其從5’端進行不同長度截短,并進行轉(zhuǎn)錄活性分析。獲... 

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
主要符號對照表
第一章 緒論
    1.1 基因組編輯體系
        1.1.1 CRISPR/Cas9 的原理
        1.1.2 CRISPR/Cas9 的發(fā)展
        1.1.3 CRISPR/Cas9 中的啟動子
    1.2 植物啟動子簡介
        1.2.1 啟動子的結(jié)構(gòu)
        1.2.2 啟動子的類別
        1.2.3 人工啟動子
        1.2.4 啟動子的功能分析
    1.3 U6啟動子
        1.3.1 U6啟動子的序列特征
        1.3.2 U6啟動子的功能特性
        1.3.3 U6啟動子的可修飾特性
    1.4 U6 啟動子在CRISPR/Cas9 體系中的應(yīng)用
    1.5 本研究的目的意義及研究內(nèi)容
        1.5.1 目的意義
        1.5.2 研究內(nèi)容
第二章 蘋果U6啟動子克隆及活性分析
    2.1 材料與方法
        2.1.1 試驗材料、試劑及儀器設(shè)備
        2.1.2 ‘金冠’蘋果基因組DNA提取
        2.1.3 蘋果U6啟動子克隆
        2.1.4 蘋果U6啟動子生物信息分析
        2.1.5 蘋果U6啟動子表達載體構(gòu)建
        2.1.6 本氏煙草和蘋果愈傷組織中的瞬時表達
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 MdU6啟動子序列分析
        2.2.2 MdU6啟動子擴增產(chǎn)物鑒定
        2.2.3 MdU6啟動子轉(zhuǎn)錄活性分析
    2.3 討論與小結(jié)
        2.3.1 討論
        2.3.2 小結(jié)
第三章 序列長度對蘋果U6啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響
    3.1 材料與方法
        3.1.1 Md U6-10-Ps和 At U6-1P的克隆
        3.1.2 Md U6-10-Ps及 At U6-1P的表達載體構(gòu)建
        3.1.3 Md U6-10-Ps和 At U6-1P的轉(zhuǎn)錄活性分析
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 MdU6-10P序列元件分析
        3.2.2 MdU6-10P不同長度截短
        3.2.3 MdU6-10-Ps的擴增產(chǎn)物鑒定
        3.2.4 MdU6-10-Ps的轉(zhuǎn)錄活性分析
        3.2.5 Md U6-10-3P和 At U6-1P的轉(zhuǎn)錄活性比較
    3.3 結(jié)論與小結(jié)
        3.3.1 討論
        3.3.2 小結(jié)
第四章 結(jié)論
參考文獻
附錄A
致謝
作者簡歷


【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
[1]CRISPR-Cas9介導(dǎo)的玉米基因組定點編輯研究[D]. 朱金潔.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[2]CRISPR/Cas9基因定點突變體系構(gòu)建與大豆抗旱相關(guān)gma-miR160功能研究[D]. 孫現(xiàn)軍.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2015



本文編號：3690412