金針菇富含豐富的氨基酸、蛋白質(zhì)和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),是深受廣大消費(fèi)者歡迎的食用菌之一,擁有廣闊的消費(fèi)市場(chǎng)和開(kāi)發(fā)前景。金針菇屬于低溫結(jié)實(shí)菌類,其子實(shí)體的發(fā)育需要經(jīng)過(guò)低溫誘導(dǎo)。金針菇的這一特點(diǎn)增加了金針菇工廠化栽培的能耗,因此,開(kāi)展對(duì)金針菇子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)理的研究,揭示金針菇子實(shí)體發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵基因,對(duì)于定向改造金針菇基因組,培育高溫型的金針菇菌株具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。本研究通過(guò)對(duì)金針菇在菌絲營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段和低溫誘導(dǎo)下原基發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序分析,結(jié)合已有關(guān)于金針菇生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的研究報(bào)道,選擇特殊轉(zhuǎn)錄因子以及子實(shí)體發(fā)育過(guò)程中重要信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的差異表達(dá)基因?yàn)槟繕?biāo)基因,借助最新的基因組編輯工具CRISPR/Cas9系統(tǒng),通過(guò)構(gòu)建基因敲除表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化金針菇原生質(zhì)體,以期能探究這些差異表達(dá)基因在金針菇子實(shí)體發(fā)育過(guò)程中的具體作用功能。主要研究結(jié)果如下:1.以金針菇Fv-Yx菌株菌絲和原基轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析為依據(jù),從大量的差異表達(dá)基因庫(kù)中篩選出轉(zhuǎn)錄因子Mads8基因、c AMP傳導(dǎo)途徑基因N1477和雙組分信號(hào)傳導(dǎo)重要激酶基因HK535共3個(gè)差異表達(dá)基因,通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物,從金針菇Fv-Y... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略詞及中文介紹
1. 前言
    1.1 金針菇的研究進(jìn)展
        1.1.1 金針菇生長(zhǎng)發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)條件
        1.1.2 金針菇生長(zhǎng)發(fā)育環(huán)境條件
        1.1.3 金針菇生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)理研究進(jìn)展
        1.1.4 真菌的雙組份系統(tǒng)
        1.1.5 真菌的cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
    1.2 MADS-box的研究進(jìn)展
        1.2.1 MADS-box的結(jié)構(gòu)和分類
        1.2.2 MADS-box的生物學(xué)功能
    1.3 CRISPR/Cas的研究進(jìn)展
        1.3.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)歷程
        1.3.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和分類
        1.3.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用機(jī)理
        1.3.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用
        1.3.5 CRISPR/Cas系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)和存在的問(wèn)題
            1.3.5.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)
            1.3.5.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的不足
            1.3.5.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的改進(jìn)方法
    1.4 本研究的目的和意義
    1.5 本研究的技術(shù)路線
2. 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 質(zhì)粒和菌株
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備
        2.1.3 培養(yǎng)基和和試劑的配制
        2.1.4 引物
        2.1.5 工具酶
        2.1.6 試劑盒
    2.2 方法
        2.2.1 轉(zhuǎn)錄組原材料的收集和測(cè)序
        2.2.2 菌絲和原基轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析、差異表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建和基因的篩選
        2.2.3 金針菇Fv-Yx單核體的篩選和出菇實(shí)驗(yàn)
            2.2.3.1 金針菇原生質(zhì)體的制備與再生
            2.2.3.2 單菌落的挑取與鏡檢
            2.2.3.3 單核體的出菇驗(yàn)證試驗(yàn)
        2.2.4 金針菇單核體菌絲和原生質(zhì)體對(duì)潮霉素的濃度敏感實(shí)驗(yàn)
            2.2.4.1 金針菇單核體菌絲對(duì)潮霉素（HmB）的最低敏感濃度檢測(cè)
            2.2.4.2 金針菇單核體原生質(zhì)體對(duì)潮霉素（HmB）的最低敏感濃度檢測(cè)
        2.2.5 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化
            2.2.5.1 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
            2.2.5.2 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的鑒定
            2.2.5.3 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
            2.2.5.4 大腸桿菌質(zhì)粒的提取
        2.2.6 金針菇菌絲和原基差異表達(dá)基因基因的克隆
            2.2.6.1 金針菇RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄cDNA的合成
            2.2.6.2 差異表達(dá)基因的克隆
            2.2.6.3 PCR產(chǎn)物檢測(cè)
            2.2.6.4 PCR產(chǎn)物純化
            2.2.6.5 PCR產(chǎn)物的測(cè)序
        2.2.7 Mads8、N1477、HK535基因gRNA載體的構(gòu)建
            2.2.7.1 啟動(dòng)子H1片段（249 bp）的克隆
            2.2.7.2 gRNA片段（118 bp）的克隆
            2.2.7.3 潮霉素完整表達(dá)框（2227 bp）的克隆
            2.2.7.4 降落重疊衍伸PCR片段融合
            2.2.7.5 gRNA表達(dá)框架與pMD18-T載體連接
        2.2.8 Mads8和HK535重組載體的構(gòu)建
            2.2.8.1 gRNA表達(dá)框的PCR克隆
            2.2.8.2 gRNA表達(dá)框和載體酶切
            2.2.8.3 gRNA表達(dá)框和載體片段的連接
            2.2.8.4 載體的PCR鑒定和酶切鑒定
        2.2.9 PEG介導(dǎo)的金針菇原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化
        2.2.10 擬轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定
            2.2.10.1 擬轉(zhuǎn)化子基因組DNA的提取
            2.2.10.2 擬轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定和T7核酸內(nèi)切酶
3. 結(jié)果與分析
    3.1 金針菇轉(zhuǎn)錄組材料的收集和測(cè)序結(jié)果分析
        3.1.1 金針菇轉(zhuǎn)錄組材料的收集
        3.1.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析
    3.2 差異表達(dá)基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果
    3.3 金針菇單核體出菇實(shí)驗(yàn)
    3.4 金針菇單核體Fy74對(duì)潮霉素濃度的敏感性測(cè)定
        3.4.1 Fy74菌絲對(duì)潮霉素濃度的敏感性實(shí)驗(yàn)
        3.4.2 金針菇單核體Fy74原生質(zhì)體對(duì)潮霉素濃度的敏感性實(shí)驗(yàn)
    3.5 差異基因gRNA載體的構(gòu)建
        3.5.1 金針菇單核體Fy74總RNA的提取和cDNA合成
        3.5.2 pgRNA-Mads8載體的構(gòu)建
            3.5.2.1 Mads8基因的克隆
            3.5.2.2 Mads8基因靶位點(diǎn)序列的選取和gRNA載體片段的克隆
            3.5.2.3 Mads8基因gRNA載體片段的融合
        3.5.3 pgRNA-N1477載體的構(gòu)建
            3.5.3.1 N1477基因的克隆
            3.5.3.2 N1477基因靶位點(diǎn)序列的選取和gRNA載體片段的克隆
            3.5.3.3 N1477基因gRNA載體片段的融合
        3.5.4 pgRNA-HK535載體的構(gòu)建
            3.5.4.1 HK535基因靶位點(diǎn)序列的選取和gRNA載體片段的克隆
            3.5.4.2 HK535基因gRNA載體片段的融合
    3.6 重組載體的構(gòu)建
        3.6.1 H1-gRNA-hph片段的克隆
        3.6.2 重組載體的PCR鑒定和酶切鑒定
    3.7 PEG介導(dǎo)的金針菇原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化
        3.7.1 PEG介導(dǎo)的金針菇原生質(zhì)體共轉(zhuǎn)化
        3.7.2 PEG介導(dǎo)的金針菇原生質(zhì)體單轉(zhuǎn)化
    3.8 擬轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定
        3.8.1 擬轉(zhuǎn)化子的篩選
        3.8.2 擬轉(zhuǎn)化子基因組DNA的提取
        3.8.3 雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化擬轉(zhuǎn)化子的鑒定
        3.8.4 重組質(zhì)粒單轉(zhuǎn)化擬轉(zhuǎn)化子的鑒定
4. 討論與結(jié)論
    4.1 討論
        4.1.1 金針菇CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建載體的策略
        4.1.2 CRISPR/Cas9基因敲除效率探討
        4.1.3 單核體制備和PEG介導(dǎo)的金針菇原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的影響因素
        4.1.4 篩選標(biāo)記基因的選擇
    4.2 全文結(jié)論
    4.3 本研究的創(chuàng)新之處
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄



本文編號(hào)：3665479