金針菇富含豐富的氨基酸、蛋白質和維生素等營養(yǎng)物質,是深受廣大消費者歡迎的食用菌之一,擁有廣闊的消費市場和開發(fā)前景。金針菇屬于低溫結實菌類,其子實體的發(fā)育需要經(jīng)過低溫誘導。金針菇的這一特點增加了金針菇工廠化栽培的能耗,因此,開展對金針菇子實體生長發(fā)育機理的研究,揭示金針菇子實體發(fā)育過程中的關鍵基因,對于定向改造金針菇基因組,培育高溫型的金針菇菌株具有重要的科學意義和應用價值。本研究通過對金針菇在菌絲營養(yǎng)生長階段和低溫誘導下原基發(fā)育階段的轉錄組進行測序分析,結合已有關于金針菇生長發(fā)育相關的研究報道,選擇特殊轉錄因子以及子實體發(fā)育過程中重要信號傳導途徑中的差異表達基因為目標基因,借助最新的基因組編輯工具CRISPR/Cas9系統(tǒng),通過構建基因敲除表達載體,轉化金針菇原生質體,以期能探究這些差異表達基因在金針菇子實體發(fā)育過程中的具體作用功能。主要研究結果如下:1.以金針菇Fv-Yx菌株菌絲和原基轉錄組數(shù)據(jù)分析為依據(jù),從大量的差異表達基因庫中篩選出轉錄因子Mads8基因、c AMP傳導途徑基因N1477和雙組分信號傳導重要激酶基因HK535共3個差異表達基因,通過設計特異性引物,從金針菇Fv-Y... 

【文章頁數(shù)】：91 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略詞及中文介紹
1. 前言
    1.1 金針菇的研究進展
        1.1.1 金針菇生長發(fā)育的營養(yǎng)條件
        1.1.2 金針菇生長發(fā)育環(huán)境條件
        1.1.3 金針菇生長發(fā)育機理研究進展
        1.1.4 真菌的雙組份系統(tǒng)
        1.1.5 真菌的cAMP信號轉導途徑
    1.2 MADS-box的研究進展
        1.2.1 MADS-box的結構和分類
        1.2.2 MADS-box的生物學功能
    1.3 CRISPR/Cas的研究進展
        1.3.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)歷程
        1.3.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的結構和分類
        1.3.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用機理
        1.3.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應用
        1.3.5 CRISPR/Cas系統(tǒng)的優(yōu)點和存在的問題
            1.3.5.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的優(yōu)點
            1.3.5.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的不足
            1.3.5.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的改進方法
    1.4 本研究的目的和意義
    1.5 本研究的技術路線
2. 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 質粒和菌株
        2.1.2 實驗儀器和設備
        2.1.3 培養(yǎng)基和和試劑的配制
        2.1.4 引物
        2.1.5 工具酶
        2.1.6 試劑盒
    2.2 方法
        2.2.1 轉錄組原材料的收集和測序
        2.2.2 菌絲和原基轉錄組數(shù)據(jù)的分析、差異表達文庫的構建和基因的篩選
        2.2.3 金針菇Fv-Yx單核體的篩選和出菇實驗
            2.2.3.1 金針菇原生質體的制備與再生
            2.2.3.2 單菌落的挑取與鏡檢
            2.2.3.3 單核體的出菇驗證試驗
        2.2.4 金針菇單核體菌絲和原生質體對潮霉素的濃度敏感實驗
            2.2.4.1 金針菇單核體菌絲對潮霉素（HmB）的最低敏感濃度檢測
            2.2.4.2 金針菇單核體原生質體對潮霉素（HmB）的最低敏感濃度檢測
        2.2.5 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉化
            2.2.5.1 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備
            2.2.5.2 大腸桿菌感受態(tài)細胞的鑒定
            2.2.5.3 大腸桿菌感受態(tài)細胞的轉化
            2.2.5.4 大腸桿菌質粒的提取
        2.2.6 金針菇菌絲和原基差異表達基因基因的克隆
            2.2.6.1 金針菇RNA的提取和反轉錄cDNA的合成
            2.2.6.2 差異表達基因的克隆
            2.2.6.3 PCR產(chǎn)物檢測
            2.2.6.4 PCR產(chǎn)物純化
            2.2.6.5 PCR產(chǎn)物的測序
        2.2.7 Mads8、N1477、HK535基因gRNA載體的構建
            2.2.7.1 啟動子H1片段（249 bp）的克隆
            2.2.7.2 gRNA片段（118 bp）的克隆
            2.2.7.3 潮霉素完整表達框（2227 bp）的克隆
            2.2.7.4 降落重疊衍伸PCR片段融合
            2.2.7.5 gRNA表達框架與pMD18-T載體連接
        2.2.8 Mads8和HK535重組載體的構建
            2.2.8.1 gRNA表達框的PCR克隆
            2.2.8.2 gRNA表達框和載體酶切
            2.2.8.3 gRNA表達框和載體片段的連接
            2.2.8.4 載體的PCR鑒定和酶切鑒定
        2.2.9 PEG介導的金針菇原生質體轉化
        2.2.10 擬轉化子的篩選與鑒定
            2.2.10.1 擬轉化子基因組DNA的提取
            2.2.10.2 擬轉化子的PCR鑒定和T7核酸內切酶
3. 結果與分析
    3.1 金針菇轉錄組材料的收集和測序結果分析
        3.1.1 金針菇轉錄組材料的收集
        3.1.2 轉錄組數(shù)據(jù)的分析
    3.2 差異表達基因轉錄組數(shù)據(jù)庫比對結果
    3.3 金針菇單核體出菇實驗
    3.4 金針菇單核體Fy74對潮霉素濃度的敏感性測定
        3.4.1 Fy74菌絲對潮霉素濃度的敏感性實驗
        3.4.2 金針菇單核體Fy74原生質體對潮霉素濃度的敏感性實驗
    3.5 差異基因gRNA載體的構建
        3.5.1 金針菇單核體Fy74總RNA的提取和cDNA合成
        3.5.2 pgRNA-Mads8載體的構建
            3.5.2.1 Mads8基因的克隆
            3.5.2.2 Mads8基因靶位點序列的選取和gRNA載體片段的克隆
            3.5.2.3 Mads8基因gRNA載體片段的融合
        3.5.3 pgRNA-N1477載體的構建
            3.5.3.1 N1477基因的克隆
            3.5.3.2 N1477基因靶位點序列的選取和gRNA載體片段的克隆
            3.5.3.3 N1477基因gRNA載體片段的融合
        3.5.4 pgRNA-HK535載體的構建
            3.5.4.1 HK535基因靶位點序列的選取和gRNA載體片段的克隆
            3.5.4.2 HK535基因gRNA載體片段的融合
    3.6 重組載體的構建
        3.6.1 H1-gRNA-hph片段的克隆
        3.6.2 重組載體的PCR鑒定和酶切鑒定
    3.7 PEG介導的金針菇原生質體轉化
        3.7.1 PEG介導的金針菇原生質體共轉化
        3.7.2 PEG介導的金針菇原生質體單轉化
    3.8 擬轉化子的篩選和鑒定
        3.8.1 擬轉化子的篩選
        3.8.2 擬轉化子基因組DNA的提取
        3.8.3 雙質粒共轉化擬轉化子的鑒定
        3.8.4 重組質粒單轉化擬轉化子的鑒定
4. 討論與結論
    4.1 討論
        4.1.1 金針菇CRISPR/Cas9系統(tǒng)構建載體的策略
        4.1.2 CRISPR/Cas9基因敲除效率探討
        4.1.3 單核體制備和PEG介導的金針菇原生質體轉化效率的影響因素
        4.1.4 篩選標記基因的選擇
    4.2 全文結論
    4.3 本研究的創(chuàng)新之處
致謝
參考文獻
附錄



本文編號：3665479