發(fā)布時間：2022-01-10 19:56

　　山葡萄漿果含有前花色苷、蛋白質(zhì)及礦物質(zhì)等營養(yǎng)元素,是具有很高經(jīng)濟(jì)價值的果樹資源。本試驗(yàn)以山葡萄果皮為材料,成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)色前果皮cDNA文庫；并利用RACE方法克隆了CHS和CHI基因cDNA全長序列,進(jìn)行了生物信息學(xué)分析；采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對山葡萄果皮成熟的7個時期的基因表達(dá)進(jìn)行了分析。主要研究結(jié)果如下：以山葡萄轉(zhuǎn)色前果皮為試驗(yàn)材料,采用In-Fusion（?） SMARTer（?） Directional cDNA Library Construction技術(shù)構(gòu)建了cDNA文庫,經(jīng)鑒定,文庫初始滴度及擴(kuò)增后滴度分別為1.15 ×106pfu.mL-1和2.86×109 pfu.mL-1,插入片段長度約為0.5-2.0 kb,平均0.9 kb,重組率高達(dá)100%。這些結(jié)果說明,本試驗(yàn)在山葡萄轉(zhuǎn)色前果皮中成功構(gòu)建了cDNA文庫。為今后山葡萄功能基因分離克隆和功能基因組學(xué)研究建立了基礎(chǔ)。通過RT-PCR結(jié)合快速擴(kuò)增cDNA末端（RACE）方法,獲得到了CHS和CHI基因的全長cDNA序列。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,這兩個基因都具有完整的開放閱讀框,其中,CHS基因的cDNA全長146... 

【文章來源】：延邊大學(xué)吉林省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 山葡萄簡介
    1.2 山葡萄花色苷概要
        1.2.1 花色苷的結(jié)構(gòu)及種類
        1.2.2 花色苷的生物合成途徑
    1.3 實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)簡介
        1.3.1 熒光定量PCR技術(shù)原理
        1.3.2 實(shí)時熒光定量PCR的定量方法
            1.3.2.1 絕對定量法
            1.3.2.2 相對定量法
        1.3.3 實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用
    1.4 研究的目的及意義
第二章 山葡萄轉(zhuǎn)色前果皮cDNA文庫的構(gòu)建
    2.1 材料與方法
        2.1.1 材料
            2.1.1.1 菌株、酶及生化試劑
            2.1.1.2 儀器設(shè)備
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1.2.1 山葡萄果皮總RNA的提取
            2.1.2.2 cDNA文庫構(gòu)建第一鏈的合成
            2.1.2.3 cDNA第二鏈的合成
            2.1.2.4 山葡萄ds cDNA的純化及片段的分級分離
            2.1.2.5 ds cDNA與pSMART2IFD載體的連接
            2.1.2.6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli
            2.1.2.7 初始文庫滴度測定與文庫的擴(kuò)增
            2.1.2.8 文庫插入片段長度與重組率檢測
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 RNA提取結(jié)果
        2.2.2 ds cDNA的合成
        2.2.3 雙鏈cDNA的分級分離
        2.2.4 cDNA文庫的質(zhì)量的評價
    2.3 討論與結(jié)論
        2.3.1 討論
        2.3.2 結(jié)論
第三章 CHS和CHI基因的克隆與分析
    3.1 材料與方法
        3.1.1 材料
            3.1.1.1 載體、菌株及主要試劑
        3.1.2 試驗(yàn)方法
            3.1.2.1 引物的設(shè)計(jì)
            3.1.2.2 山葡萄總RNA的提取
            3.1.2.3 反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈的合成
            3.1.2.4 PCR擴(kuò)增目的基因片段
            3.1.2.5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的膠回收
            3.1.2.6 回收產(chǎn)物與載體連接
            3.1.2.7 大腸桿菌感受態(tài)的轉(zhuǎn)化及測序
            3.1.2.8 RACE法cDNA末端的快速克隆
            3.1.2.9 目的基因cDNA全長序列的生物信息學(xué)分析
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 總RNA的提取與檢測
        3.2.2 CHS基因的克隆與分析
            3.2.2.1 VamCHS cDNA全長序列的克隆與分析
            3.2.2.2 VamCHS編碼蛋白質(zhì)理化性狀分析
            3.2.2.3 VamCHS蛋白的保守區(qū)分析
            3.2.2.4 VamCHS蛋白的親水性分析
            3.2.2.5 VamCHS蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析
            3.2.2.6 VamCHS蛋白的信號肽及二級結(jié)構(gòu)分析
            3.2.2.7 VamCHS蛋白的細(xì)胞定位分析
            3.2.2.8 VamCHS編碼蛋白質(zhì)的同源性及進(jìn)化樹
        3.2.3 CHI基因的克隆與分析
            3.2.3.1 VamCHI cDNA全長序列的克隆與分析
            3.2.3.2 VamCHI基因編碼蛋白質(zhì)理化性狀分析
            3.2.3.3 VamCHI蛋白的保守區(qū)分析
            3.2.3.4 VamCHI蛋白的親水性分析
            3.2.3.5 VamCHI蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域分析
            3.2.3.6 VamCHI蛋白的信號肽預(yù)測及二級結(jié)構(gòu)分析
            3.2.3.7 VamCHI蛋白的細(xì)胞定位分析
            3.2.3.8 VamCHI編碼蛋白質(zhì)的同源性及進(jìn)化分析
    3.3 討論與結(jié)論
        3.3.1 討論
        3.3.2 結(jié)論
第四章 山葡萄著色過程中VamCHS和VamCHI的表達(dá)分析
    4.1 材料與方法
        4.1.1 試驗(yàn)材料
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 主要儀器與設(shè)備
        4.1.4 試驗(yàn)方法
            4.1.4.1 RNA的提取
            4.1.4.2 模版cDNA第一鏈的制備
            4.1.4.3 PCR引物設(shè)計(jì)及合成
            4.1.4.4 引物的普通PCR驗(yàn)證
            4.1.4.5 引物特異性的驗(yàn)證
            4.1.4.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
            4.1.4.7 VamCHS和VamCHI基因的相對表達(dá)量分析
            4.1.4.8 數(shù)據(jù)處理
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 RNA的提取
        4.2.2 實(shí)時熒光定量PCR引物的常規(guī)PCR擴(kuò)增
        4.2.3 實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
        4.2.4 VamCHS和VamCHI基因在果皮不同時期的表達(dá)水平分析
    4.3 討論與結(jié)論
        4.3.1 討論
        4.3.2 結(jié)論
第五章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]山葡萄總RNA提取方法的比較[J]. 付陽,劉海峰,李娟,李翔國.  延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報. 2013(04)
[2]觀賞桃查爾酮合成酶基因的克隆及其序列分析[J]. 林玲,湯浩茹,陳清,魯敏,賈慧峰,李英改,張曉楠.  園藝學(xué)報. 2012(03)
[3]植物花青素生物代謝調(diào)控[J]. 郭鳳丹,王效忠,劉學(xué)英,夏晗,王興軍.  生命科學(xué). 2011(10)
[4]中國山葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及對策[J]. 宋潤剛,艾軍,李曉紅,楊義明,沈育杰.  中外葡萄與葡萄酒. 2009(11)
[5]巨峰葡萄查爾酮異構(gòu)酶基因克隆及表達(dá)分析[J]. 周軍,姚泉洪,彭日荷,熊愛生,蔡斌,徐錦濤,金曉芬,陶建敏,章鎮(zhèn).  西北植物學(xué)報. 2009(09)
[6]實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的類型、特點(diǎn)與應(yīng)用[J]. 袁亞男,劉文忠.  中國畜牧獸醫(yī). 2008(03)
[7]玉米根部酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建及評價[J]. 崔紅軍,張軍杰,黃玉碧.  分子植物育種. 2008(01)
[8]水中輪狀病毒實(shí)時定量PCR外標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建[J]. 胡秀華,何苗,劉麗,李丹,施漢昌.  環(huán)境科學(xué). 2008(02)
[9]花青素研究進(jìn)展[J]. 李娟娟.  中山大學(xué)研究生學(xué)刊(自然科學(xué)、醫(yī)學(xué)版). 2007(02)
[10]花青素研究進(jìn)展[J]. 李娟娟.  中山大學(xué)研究生學(xué)刊(自然科學(xué)、醫(yī)學(xué)版). 2007 (02)

博士論文
[1]新城疫病毒的熒光定量RT-PCR檢測及RNA干涉[D]. 岳華.西南大學(xué) 2006

碩士論文
[1]雞馬立克氏病病毒TaqMan探針雙重?zé)晒舛縋CR檢測方法的建立及應(yīng)用[D]. 張穎.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 2006



本文編號：3581322