柑橘鮮果周年供應(yīng)、豐富早晚熟柑橘品種是我國柑橘產(chǎn)業(yè)重點(diǎn)研究內(nèi)容之一。由于柑橘童期長,且常規(guī)育種手段效率極低,因此利用分子技術(shù)進(jìn)行柑橘熟期育種成為了重要的育種手段,解析柑橘果實(shí)成熟調(diào)控分子機(jī)理對(duì)柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的研究意義和應(yīng)用價(jià)值。前人對(duì)轉(zhuǎn)錄因子Cs MYB77（Cs3g23950）遺傳轉(zhuǎn)化番茄,初步確定該基因具有延遲果實(shí)成熟的功能。本研究在此基礎(chǔ)上,對(duì)Cs MYB77遺傳轉(zhuǎn)化山金柑,進(jìn)行q RT-PCR分析、雙分子熒光互補(bǔ)和雙熒光素酶等互作驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),確定轉(zhuǎn)錄因子Cs MYB77的下游靶基因,進(jìn)一步闡釋了該轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控柑橘果實(shí)成熟的分子機(jī)制,為柑橘的熟期育種提供一定的理論基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:1.對(duì)Cs MYB77超表達(dá)遺傳轉(zhuǎn)化番茄株系T3代進(jìn)行表型觀察與統(tǒng)計(jì),果實(shí)破色期比野生型（WT）和空載對(duì)照組（Control）延遲了3-5天,經(jīng)過3代觀察,Cs MYB77超表達(dá)番茄株系延遲果實(shí)成熟性狀穩(wěn)定。對(duì)番茄ARFs家族基因進(jìn)行q RT-PCR實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示基因Sl ARF6與番茄果實(shí)破色相關(guān),基因Sl ARF8與Sl ARF14上調(diào)表達(dá)明顯。2.將Cs MYB77-OE、Cs MYB77... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

技術(shù)路線圖

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2020屆碩士研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文102.材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1植物材料本研究遺傳轉(zhuǎn)化采用山金柑，山金柑定植于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國家柑橘育種中心；Mic-Tom番茄來源于本實(shí)驗(yàn)，包括野生型（WT）、空載對(duì)照（Control）和CsMYB77T3代超表達(dá)株系。2.1.2主要試劑ExTaq酶和Trizol購自大連Takara公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiFiScriptgDNARemovalcDNASynthesisKit購于北京康為世紀(jì)，AppliedBiosystemsPowerUpSYBRGreen預(yù)混液購于賽默飛世爾公司，所用引物由武漢天一輝遠(yuǎn)公司合成。2.2方法2.2.1番茄表型統(tǒng)計(jì)觀察2.2.1.1番茄開花到果實(shí)著色時(shí)間統(tǒng)計(jì)番茄材料開花后，選取盛花期花朵人工掛牌并標(biāo)注日期（圖2-1），選擇與圖中12.6形態(tài)一致的花朵作為番茄的盛花期即0DAF進(jìn)行掛牌。統(tǒng)計(jì)野生型、空載對(duì)照及轉(zhuǎn)基因材料從盛花到果實(shí)開始著色所需時(shí)間，即破色天數(shù)。圖2-1番茄盛花0DAF起始形態(tài)選擇（徐陽，2018）Fig.2-1Tomatoflower0DAFinitialmorphologyselection2.2.2番茄果實(shí)的基因表達(dá)分析

轉(zhuǎn)錄因子CsMYB77遺傳轉(zhuǎn)化功能驗(yàn)證及其互作基因挖掘213.結(jié)果與分析3.1CsMYB77番茄超表達(dá)株系T3代表型分析3.1.1番茄果實(shí)表型觀察與統(tǒng)計(jì)CsMYB77番茄超表達(dá)T2代株系果實(shí)出現(xiàn)性狀分離，因此繼續(xù)播種T3代持續(xù)觀察番茄超表達(dá)株系表型。統(tǒng)計(jì)T3代野生型（WT）、空載對(duì)照（Control）和CsMYB77-OE番茄果實(shí)的破色天數(shù)，結(jié)果顯示，超表達(dá)株系的破色天數(shù)全部顯著高于野生型（WT），而與Control相比，CsMYB77-13株系的破色天數(shù)顯著高于Control，其余超表達(dá)株系與Control相比有差異，但差異不太顯著（圖3-1，A）。超表達(dá)番茄T3代各株系果實(shí)照片如圖3-1B，WT和Control果實(shí)分別在34DAF和35DAF開始著色，CsMYB77-13株系果實(shí)著色起始時(shí)間在38DAF，CsMYB77-22株系和CsMYB77-31株系的番茄果實(shí)均在37DAF開始著色。結(jié)果表明，超表達(dá)番茄果實(shí)的破色天數(shù)相較于野生型（WT）和空載對(duì)照組（Control）延遲了3-4天，經(jīng)過3代觀察，該基因延遲番茄果實(shí)成熟性狀穩(wěn)定。圖3-1T3代WT、Control和CsMYB77-OE株系果實(shí)表型A:WT、Control和超表系的果實(shí)破色天數(shù)統(tǒng)計(jì)，其中，nWT=18,nControl=25,nCsMYB77-13=13,nCsMYB77-22=24,nCsMYB77-31=9，ABC表示P≤0.01水平差異

【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
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