百合無癥病毒（Lily symptomless virus, LSV）是香石竹潛隱病毒屬（Carlavirus）中的一種,能夠嚴(yán)重危害百合種球質(zhì)量和鮮切花品質(zhì),是侵染百合的三大病毒之一。病毒為單鏈正義RNA,含有6個(gè)開放閱讀框（ORF）,編碼4個(gè)蛋白,依5’至3’分別編碼：RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）,三基因連鎖運(yùn)動(dòng)蛋白（TGB1-3）,外殼蛋白（CP）和未知功能蛋白（16kDa）。本研究以感染LSV的百合葉片為試材,通過RT-PCR克隆LSV基因16kDa。將該基因連接至原核表達(dá)載體pET-28a（+）,重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）, IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并通過SDS-PAGE及質(zhì)譜分析,證明得到高效表達(dá)的16kDa融合蛋白,蛋白以包涵體形式存在。經(jīng)鎳柱純化后得到純度較高的蛋白。將純化蛋白16kDa和TGB1分別作為抗原免疫小鼠,制備16kDa和TGB1蛋白抗血清,間接ELISA檢測(cè)抗血清效價(jià)較高。通過Western blot分析,制備的特異性抗血清能與16kDa, TGB1以及百合葉片總蛋白反應(yīng),均出現(xiàn)目的雜交條帶。制備的抗血清可用于病毒檢測(cè)、蛋白質(zhì)印跡、免疫組織化學(xué)... 

【文章來源】：大連理工大學(xué)遼寧省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：83 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 百合及病毒防治
        1.1.1 百合概述
        1.1.2 百合病毒的危害
        1.1.3 百合病毒的檢測(cè)
        1.1.4 百合病毒的防治
    1.2 百合無癥病毒概述
        1.2.1 百合無癥病毒編碼蛋白結(jié)構(gòu)及功能
        1.2.2 16kDa,TGB1蛋白研究進(jìn)展
    1.3 RNA沉默抑制子概述
        1.3.1 植物病毒沉默抑制子的發(fā)現(xiàn)
        1.3.2 沉默抑制子作用機(jī)制
        1.3.3 沉默抑制子的鑒定法
        1.3.4 沉默抑制子研究進(jìn)展
        1.3.5 細(xì)胞定位
    1.4 研究目的、意義及內(nèi)容
        1.4.1 研究目的、意義
        1.4.2 研究?jī)?nèi)容
2 百合無癥病毒16kDa蛋白原核表達(dá)及純化
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
    2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 原核表達(dá)載體pET28a-16kDa的構(gòu)建
        2.3.2 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE檢測(cè)
        2.3.3 融合蛋白的Western blot檢測(cè)
        2.3.4 融合蛋白16kDa質(zhì)譜分析
        2.3.5 融合蛋白的純化
        2.3.6 純化蛋白濃度的測(cè)定
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        2.4.1 原核表達(dá)載體pET28a-16kDa的構(gòu)建
        2.4.2 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE電泳檢測(cè)
        2.4.3 融合蛋白的Western blot檢測(cè)
        2.4.4 融合蛋白16kDa質(zhì)譜分析
        2.4.5 融合蛋白的純化
        2.4.6 純化蛋白濃度的測(cè)定
    2.5 討論
    2.6 小結(jié)
3 百合無癥病毒16kDa,TGB1蛋白抗血清制備及檢測(cè)
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
    3.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 16 kDa,TGB1抗血清制備及抗血清效價(jià)測(cè)定
        3.3.2 Western blot檢測(cè)
        3.3.3 百合無癥病毒檢測(cè)
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        3.4.1 16 kDa,TGB1抗血清制備及抗血清效價(jià)測(cè)定
        3.4.2 Western blot檢測(cè)
        3.4.3 百合無癥病毒檢測(cè)
    3.5 討論
    3.6 小結(jié)
4 百合無癥病毒16kDa,TGB1沉默抑制子的鑒定與研究
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
    4.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 重組載體構(gòu)建
        4.3.2 農(nóng)桿菌浸潤接種及鑒定
        4.3.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)
        4.3.4 Western blot分析
        4.3.5 細(xì)胞定位
    4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        4.4.1 重組載體構(gòu)建
        4.4.2 RNA沉默抑制子的鑒定
        4.4.3 細(xì)胞定位
    4.5 討論
    4.6 小結(jié)
5 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 展望
參考文獻(xiàn)
附錄A 論文病毒序列
附錄B 質(zhì)粒圖譜及實(shí)驗(yàn)所用Marker
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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[3]利用GISH和SRAP分子標(biāo)記技術(shù)鑒定20個(gè)百合雜交F1的代親本類型[D]. 于暉.西南大學(xué) 2010
[4]農(nóng)桿菌介導(dǎo)NPR1基因?qū)Π俸线z傳轉(zhuǎn)化的研究[D]. 王莎莎.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008
[5]侵染百合和水仙的部分線狀植物病毒外殼蛋白基因的原核表達(dá)、抗血清制備及檢測(cè)應(yīng)用[D]. 沈嘉樂.浙江大學(xué) 2006
[6]百合無癥病毒的RT-PCR和核酸雜交檢測(cè)及其外殼蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)[D]. 李燕.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2005



本文編號(hào)：3460681