柑橘在我國(guó)水果產(chǎn)業(yè)中占據(jù)了十分重要的經(jīng)濟(jì)地位,然而其產(chǎn)量和品質(zhì)受周期性凍害影響嚴(yán)重。因此,開展柑橘的抗寒育種研究十分重要。遺傳轉(zhuǎn)化是獲得抗逆種質(zhì)的途徑之一。本研通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將從枳（Poncirus trifoliata）中克隆的ERF109和ZFP1基因?qū)霗幟剩–itruslimon）,獲得了轉(zhuǎn)基因植株并初步進(jìn)行抗性分析。取得的主要結(jié)果如下:1、轉(zhuǎn)化和再生:ERF109基因累計(jì)轉(zhuǎn)化檸檬上胚軸800個(gè),獲得再生芽體200個(gè);ZFP1基因累計(jì)轉(zhuǎn)化檸檬上胚軸600個(gè),獲得再生芽體300個(gè)。2、再生植株分子鑒定:對(duì)再生芽進(jìn)行PCR陽(yáng)性鑒定,共得到檸檬轉(zhuǎn)ERF109陽(yáng)性苗22株,檸檬轉(zhuǎn)ZFP1陽(yáng)性苗6株。采用半定量PCR和實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)部分陽(yáng)性苗進(jìn)行目的基因表達(dá)量分析,結(jié)果表明在轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株中,目的基因表達(dá)水平比野生型對(duì)照均有不同程度的提高。3、ERF109和ZFP1轉(zhuǎn)基因植株抗寒性分析:分別對(duì)ERF109和ZFP1檸檬轉(zhuǎn)基因株系和野生型植株進(jìn)行低溫處理,結(jié)果表明低溫處理后野生型對(duì)照的葉片萎蔫更嚴(yán)重,電導(dǎo)率明顯高于轉(zhuǎn)基因株系。該結(jié)果初步證明了 ERF109和ZFP1轉(zhuǎn)基因檸檬抗... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：57 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖２?￡７？／７０９－ＰＢ１１２１表達(dá)栽體示意圖??Ｆｉ．?２?ＥＲＦ１Ｇ９－ＰＢ１１２１?ｅｘｒｅｓｓｉｏｎ?ｖｅｃｔｏｒ?ｍａ

之后進(jìn)行進(jìn)一步的擴(kuò)繁（附錄Ｉ－Ｆ）。??３．１．２轉(zhuǎn)基因材料陽(yáng)性鑒定??本實(shí)驗(yàn)使用兩對(duì)特異基因引物對(duì)轉(zhuǎn)基因系分別進(jìn)行基因組ＰＣＲ擴(kuò)增。如圖３所??示，五川９和ＭＴ／／基因均從部分待檢測(cè)株系中擴(kuò)增出了與質(zhì)粒ＤＮＡ??大小相同的片段，片段大小分別為１７００?ｂｐ和７４０?ｂｐ，而在野生對(duì)照植株則沒有出??現(xiàn)相應(yīng)的片段，表明沿？Ｆ川９己經(jīng)成功整合到檸檬基因組中。??Ｍ?Ｐ?水?ＷＴ?＃６?＃１２?＃１３?＃１４?＃１５?＃１８?＃２３?＃２９＃３８?＃４０?＃４１?＃４２?＃４５?＃４８??圖３轉(zhuǎn)基因株系分子鑒定。Ａ：特異基因引物仍的ＰＣＲ擴(kuò)增，ＢｓＭＴ／／引物ＰＣＲ??擴(kuò)增，Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ，?Ｐ：質(zhì)粒，其他：轉(zhuǎn)基因株系??Ｆｉｇ．?３?Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ?ｌｉｎｅｓ．?Ａ：?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ?ｐｌａｎｔｓ?ｖｉａ??ｓｐｅｃｉｆｉｃ?ｐｒｉｍｅｒｓ?ｏｆ?ＣａＭＶ３５Ｓ－ＥＲＦ１０９，?Ｂ：?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ?ｐｌａｎｔｓ?ｖｉａ?ｓｐｅｃｉｆｉｃ?ｐｒｉｍｅｒｓ??ｏｆ?ＮＰＴＩＩ，?Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ，?Ｐ：?Ｐｌａｓｍｉｄ，?Ｏｔｈｅｒｓ：?ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ?

３．１．３轉(zhuǎn)基因材料表達(dá)量分析??將鑒定出的陽(yáng)性株系的ＲＮＡ提取出來，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成ｃＤＮＡ之后作為模板，分??別通過半定量（圖４）和定量（圖５）的方法對(duì)其進(jìn)行表達(dá)量分析。??ＷＴ?＃６?＃１３?＃３８?＃４０??Ａｃｔｉｎ?．、?＇?＇??圖４?基因在ＷＴ及轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)分析??Ｆｉｇ．?４?Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＥＲＦ１０９?ｉｎ?ｔｈｅ?ＷＴ?ａｎｄ?ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ?ｌｉｎｅｓ??１５????１４?－?．？??１３?－??Ｃ／５?＞?－４?＾??１２??＾?１１．?￡?ｆ久??１?：：??ｃｌ?７?．??Ｓ?５?＊?ＫＨ??Ｉ?＾??違?｜［?Ｍ?Ｉ?Ｉ?■??ＷＴ?＃６?＃１３?＃３８??圖５實(shí)時(shí)定量檢測(cè)基因的表達(dá)量??Ｆｉｇ．?５?Ｔｈｅ?ｒｅｌａｔｉｖｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｌｅｖｅｌｓ?ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ?ｂｙ?ｑＲＴ－ＰＣＲ??本研究采用實(shí)時(shí)定量ＰＣＲ檢測(cè)了基因在幻？Ｆ川９轉(zhuǎn)基因株系及野生型植株中表??達(dá)水平。如圖５所示，轉(zhuǎn)基因株系中基因的表達(dá)量均高于野生型對(duì)照。這個(gè)結(jié)果表??明外源基因在轉(zhuǎn)基因檸檬中能夠正常表達(dá)，但是表達(dá)水平在不同轉(zhuǎn)基因系中差異較??大。??２７??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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[2]農(nóng)桿菌介導(dǎo)的MdSPDS1、AhBADH、PtrICE1基因轉(zhuǎn)化柑橘及轉(zhuǎn)基因植株抗性機(jī)理研究[D]. 付行政.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
[3]柑橘CBF類似基因低溫脅迫下的表達(dá)與分析[D]. 何利剛.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010
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[5]ERF轉(zhuǎn)錄因子TSRF1的功能分析[D]. 張洪博.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 2005
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碩士論文
[1]紐荷爾臍橙主產(chǎn)區(qū)果實(shí)品質(zhì)特征與產(chǎn)地識(shí)別研究[D]. 廖秋紅.西南大學(xué) 2014
[2]枳PtrbHLH基因的抗寒功能鑒定[D]. 張倩.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012
[3]轉(zhuǎn)MdSPDS1基因柑橘在低、高溫下抗性表現(xiàn)[D]. 劉佳.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007
[4]根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)亞精胺合成酶基因MdSPDS1的柑橘遺傳轉(zhuǎn)化及離體再生[D]. 瞿金旺.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2006
[5]利用柑橘莖段誘導(dǎo)不定芽改進(jìn)微芽嫁接脫毒技術(shù)的研究[D]. 陳澤雄.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2005



本文編號(hào)：3460069