番茄作為蔬菜栽培中的第一大作物,其適宜的溫度范圍為13～33℃。在我國設(shè)施番茄栽培中,冬春季節(jié)的低溫成為影響番茄產(chǎn)量與質(zhì)量的重要限制因子。而普通番茄中抗低溫種質(zhì)資源匱乏,本試驗(yàn)針對(duì)從生長在極端低溫環(huán)境中的新疆沙冬青幼苗低溫誘導(dǎo)差減抑制雜交庫中分離到的肌醇半乳糖苷合成酶基因EST片段（命名為AnGolS1）利用RACE方法,獲得了AnGolS1全長序列（GenBank登錄號(hào)：GU942748）,分析了基因及其編碼蛋白的特性,研究了低溫下該基因的表達(dá)模式,并在此基礎(chǔ)上,將該基因轉(zhuǎn)入栽培番茄中,以期提高栽培番茄對(duì)低溫的抗性。論文的主要結(jié)論如下：（1）根據(jù)pET30a（+）具有HIS標(biāo)簽的特性,利用酶切連接的方法構(gòu)建了pET30a（+）-AnGolS1重組質(zhì)粒；利用IPTG誘導(dǎo)AnGolS1融合蛋白表達(dá),Ni+樹脂純化融合蛋白并用來催化底物反應(yīng)；通過HPLC分析不同反應(yīng)時(shí)間產(chǎn)物肌醇半乳糖苷的含量,AnGolS1催化底物反應(yīng)非常迅速,推測AnGolS1很可能是一個(gè)快速反應(yīng)酶并且酶活性有效時(shí)間為40min。（2）利用qRT-PCR技術(shù)分析不同脅迫下幼苗根、莖及葉中AnGolS1表達(dá)量變化,結(jié)果顯示... 

【文章來源】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)遼寧省

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 低溫與植物生長發(fā)育
        1.1.1 低溫影響種子萌發(fā)
        1.1.2 低溫影響植物花器官分化及發(fā)育
    1.2 低溫與植物代謝途徑
        1.2.1 低溫對(duì)植物光合作用影響
        1.2.2 低溫影響植物呼吸作用
    1.3 低溫與細(xì)胞結(jié)構(gòu)
    1.4 低溫與植物體內(nèi)代謝物質(zhì)變化
        1.4.1 低溫對(duì)蛋白質(zhì)活性影響
        1.4.2 低溫對(duì)激素的影響
        1.4.3 低溫與可溶性糖
    1.5 低溫與基因表達(dá)
        1.5.1 低溫脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子
        1.5.2 肌醇半乳糖苷合成酶與低溫脅迫
    1.6 新疆沙冬青特點(diǎn)
    1.7 立題依據(jù)及目的意義
2 材料與方法
    2.1 新疆沙冬青肌醇半乳糖苷合成酶基因克隆
        2.1.1 AnGolS1 EST片段分離
        2.1.2 5'RACE擴(kuò)增
        2.1.3 3'RACE擴(kuò)增
        2.1.4 序列拼接及生物信息學(xué)分析
    2.2 AnGolS1體外酶活性檢測
        2.2.1 原核表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建
        2.2.2 IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)及純化
        2.2.3 催化底物反應(yīng)及HPLC分析
    2.3 qRT-PCR分析不同逆境處理下AnGolS1基因表達(dá)量
    2.4 低溫脅迫下不同組織切片ISH原位雜交
        2.4.1 組織切片制備
        2.4.2 ISH DIG-labeling probe制備
        2.4.3 ISH雜交實(shí)驗(yàn)
    2.5 AnGolS1轉(zhuǎn)基因番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建
        2.5.1 轉(zhuǎn)基因重組載體構(gòu)建
        2.5.2 轉(zhuǎn)基因幼苗培育
        2.5.3 轉(zhuǎn)基因番茄T0代鑒定
        2.5.4 轉(zhuǎn)基因番茄T0代培育
3 結(jié)果與分析
    3.1 AnGolS1全長克隆
        3.1.1 AnGolS1基因5'-UTR區(qū)PCR擴(kuò)增
        3.1.2 AnGolS1基因3'-UTR區(qū)PCR擴(kuò)增
        3.1.3 AnGolS1基因全長拼接
        3.1.4 生物信息學(xué)分析
    3.2 AnGolS1體外酶活性分析
        3.2.1 pET30a(+)-AnGolS1重組質(zhì)粒鑒定
        3.2.2 AnGolS1融合蛋白表達(dá)及純化電泳檢測
        3.2.3 體外酶活性檢測
    3.3 逆境脅迫下AnGolS1基因表達(dá)量變化
        3.3.1 低溫脅迫下幼苗根、莖、葉AnGolS1表達(dá)量變化
        3.3.2 干旱脅迫下根、莖、葉AnGolS1表達(dá)量變化
        3.3.3 鹽脅迫下根、莖、葉AnGolS1表達(dá)量變化
    3.4 AnGolS1基因組織細(xì)胞定位
        3.4.1 ISH雜交正義及反義探針RNA合成
        3.4.2 低溫脅迫下幼根切片ISH原位雜交
        3.4.3 低溫脅迫下幼莖切片ISH原位雜交
        3.4.4 低溫脅迫下幼苗葉片切片ISH原位雜交
        3.4.5 低溫脅迫下幼苗下胚軸切片ISH原位雜交
    3.5 AnGolS1轉(zhuǎn)基因番茄遺傳轉(zhuǎn)化
        3.5.1 AnGolS1轉(zhuǎn)基因載體檢測
        3.5.2 T0代轉(zhuǎn)基因番茄植株陽性鑒定
4 討論
    4.1 AnGolS1基因的潛在功能
    4.2 逆境下AnGolS1基因表達(dá)分析
    4.3 低溫處理下AnGolS1基因定位分析
    4.4 AnGolS1轉(zhuǎn)基因番茄獲得
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
圖版
致謝



本文編號(hào)：3426414