發(fā)布時(shí)間：2021-08-03 11:10

　　金針菇（Flammulina velutipes）在東南亞乃至全世界范圍內(nèi)都是一種極其重要的食藥用真菌。它以其獨(dú)特的口感和良好的營(yíng)養(yǎng)、藥用價(jià)值在東亞尤其是中日韓等國(guó)家贏得了眾多消費(fèi)者的喜愛(ài)。但由于金針菇中遺傳轉(zhuǎn)化體系的缺乏,限制了金針菇的生物學(xué)研究進(jìn)展。本研究首次將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法成功引入到金針菇中,獲得了 一個(gè)簡(jiǎn)單有效的金針菇遺傳轉(zhuǎn)化體系。在金針菇中,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化法的轉(zhuǎn)化效率能夠高達(dá)60-80個(gè)轉(zhuǎn)化子/104個(gè)原生質(zhì)體,而電擊轉(zhuǎn)化法的轉(zhuǎn)化效率為10-20個(gè)轉(zhuǎn)化子/104個(gè)原生質(zhì)體,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的轉(zhuǎn)化效率僅為5-10個(gè)轉(zhuǎn)化子/104個(gè)原生質(zhì)體;脂質(zhì)體介導(dǎo)的金針菇遺傳轉(zhuǎn)化體系5-6天就能觀察到轉(zhuǎn)化子,而電擊轉(zhuǎn)化方法要到10天時(shí)才能發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法則需要兩周。相比較而言,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法所需培養(yǎng)時(shí)間更短,轉(zhuǎn)化效率更高。為了研究漆酶基因在金針菇生長(zhǎng)發(fā)育中的作用,本研究使用建立的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系篩選得到漆酶基因的沉默菌株和過(guò)表達(dá)菌株。在金針菇中共比對(duì)到9條漆酶序列,應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)金針菇中的漆酶基因表達(dá)量,結(jié)果表明:Lac1,Lac2,Lac3,Lac4的基因表達(dá)量較高,而Lac5,La... 

【文章來(lái)源】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：70 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
符號(hào)和縮略語(yǔ)說(shuō)明
第一章 文獻(xiàn)綜述
    第一節(jié) 金針菇的概述
        1.1 金針菇的分類(lèi)地位
        1.2 金針菇的組成部分
            1.2.1 金針菇菌蓋形態(tài)特征
            1.2.2 金針菇菌褶形態(tài)特征
            1.2.3 金針菇菌柄形態(tài)特征
        1.3 金針菇營(yíng)養(yǎng)價(jià)值
        1.4 金針菇藥用價(jià)值
            1.4.1 金針菇具有免疫調(diào)節(jié)作用
            1.4.2 金針菇具有護(hù)肝作用
            1.4.3 金針菇具有抗腫瘤作用
    第二節(jié) 脂質(zhì)體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展
        2.1 目前絲狀真菌中主要的遺傳轉(zhuǎn)化方法
            2.1.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法
            2.1.2 電擊法
            2.1.3 限制酶介導(dǎo)的DNA整合法
        2.2 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法的簡(jiǎn)介
        2.3 金針菇中遺傳轉(zhuǎn)化方法的研究
    第三節(jié) 漆酶基因家族的簡(jiǎn)介
        3.1 漆酶的命名和分類(lèi)
        3.2 漆酶的特性
        3.3 漆酶基因家族與菌絲生長(zhǎng)、子實(shí)體形成有關(guān)
    第四節(jié) 本論文的研究?jī)?nèi)容及意義
        4.1 研究意義
        4.2 研究?jī)?nèi)容
第二章 脂質(zhì)體介導(dǎo)的金針菇遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立
    前言
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 菌株、質(zhì)粒、試劑
        1.2 菌株培養(yǎng)條件
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 金針菇原生質(zhì)體的制備
        2.2 脂質(zhì)體介導(dǎo)的金針菇轉(zhuǎn)化體系
        2.3 金針菇電擊轉(zhuǎn)化體系
        2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的金針菇轉(zhuǎn)化體系
        2.5 金針菇轉(zhuǎn)化子的分子水平驗(yàn)證
        2.6 GFP報(bào)告基因的檢測(cè)
        2.7 金針菇轉(zhuǎn)化子有絲分裂穩(wěn)定性驗(yàn)證
    3 結(jié)果與分析
        3.1 潮霉素抗性濃度篩選結(jié)果
        3.2 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化結(jié)果
        3.3 潮霉素?cái)U(kuò)增驗(yàn)證隨機(jī)挑取的轉(zhuǎn)化子
        3.4 轉(zhuǎn)化子綠色熒光的檢測(cè)
        3.5 金針菇脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化子有絲分裂穩(wěn)定性驗(yàn)證
        3.6 金針菇三種轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化效率的比較
        3.7 金針菇三種轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化子獲得的時(shí)間比較
    4 本章討論
第三章 漆酶基因?qū)疳樄缴L(zhǎng)發(fā)育的影響
    前言
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 實(shí)驗(yàn)菌株和試劑
        1.2 菌株培養(yǎng)條件
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 金針菇基因組DNA的提取(CTAB法)
        2.2 金針菇總RNA的提取和cDNA的反轉(zhuǎn)錄
        2.3 Lac2i沉默載體的構(gòu)建
            2.3.1 Lac2i沉默片段的克隆
            2.3.2 Lac2沉默目的片段雙酶切和目的片段的回收
            2.3.3 Lac2沉默質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.4 Lac2過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.4.1 金針菇cDNA的合成
            2.4.2 Lac2的全長(zhǎng)擴(kuò)增
            2.4.3 載體Fv-GPIE和目的片段的雙酶切反應(yīng)
            2.4.4 目的片段的回收與克隆
            2.4.5 片段與載體的連接
        2.5 Lac2基因沉默載體和過(guò)表達(dá)載體的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化
        2.6 轉(zhuǎn)化子的篩選及PCR驗(yàn)證
            2.6.1 金針菇DNA的提取
            2.6.2 轉(zhuǎn)化子的PCR驗(yàn)證
        2.7 轉(zhuǎn)化子中Lac2基因mRNA水平表達(dá)量的影響
            2.7.1 金針菇總RNA的提取及cDNA制備
            2.7.2 熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)化子沉默效率和過(guò)表達(dá)效率
        2.8 漆酶活性測(cè)定
            2.8.1 平板檢測(cè)法
            2.8.2 分光光度法測(cè)定漆酶的活性
        2.9 纖維素酶活性檢測(cè)
        2.10 漆酶基因Lac2轉(zhuǎn)化子在生長(zhǎng)方面的變化
            2.10.1 不同轉(zhuǎn)化子在平板上的生長(zhǎng)差異
            2.10.2 不同轉(zhuǎn)化子在液體發(fā)酵中生物量的變化
        2.11 漆酶基因Lac2沉默和過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子的吃料實(shí)驗(yàn)
            2.11.1 培養(yǎng)料的配制
            2.11.2 不同轉(zhuǎn)化子吃料能力的比較
        2.12 漆酶基因Lac2沉默和過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子出原基情況
    3 結(jié)果與分析
        3.1 金針菇中的漆酶序列
        3.2 金針菇不同漆酶在發(fā)酵過(guò)程中轉(zhuǎn)錄水平差異分析
        3.3 金針菇中漆酶序列相似性比較
        3.4 金針菇漆酶沉默和過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建過(guò)程中部分電泳圖
            3.4.1 金針菇總RNA的獲得
            3.4.2 金針菇Lac2沉默片段的獲取
            3.4.3 金針菇Lac2全長(zhǎng)序列的獲取
        3.5 漆酶基因Lac2轉(zhuǎn)化子的分子水平驗(yàn)證
        3.6 漆酶基因Lac2、Lac3、Lac4在轉(zhuǎn)化子中轉(zhuǎn)錄水平的變化
        3.7 漆酶基因Lac2的沉默轉(zhuǎn)化子和過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子中漆酶活性的變化
            3.7.1 平板檢測(cè)法
            3.7.2 分光光度法測(cè)定漆酶活性
        3.8 漆酶基因的沉默轉(zhuǎn)化子和過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子中纖維素酶活性的變化
        3.9 漆酶基因Lac2沉默轉(zhuǎn)化子和過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子在平板上的生長(zhǎng)差異
        3.10 漆酶基因Lac2沉默轉(zhuǎn)化子和過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子生物量的變化
        3.11 漆酶基因Lac2沉默轉(zhuǎn)化子和過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子吃料實(shí)驗(yàn)
        3.12 漆酶基因Lac2沉默轉(zhuǎn)化子和過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子原基發(fā)生實(shí)驗(yàn)
    4 本章討論
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]金針菇多糖研究進(jìn)展[J]. 劉孝永,陳蕾蕾,裘紀(jì)瑩,孫欣,王未名,周慶新,杜方嶺.  中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng). 2012(05)
[2]金針菇多糖的研究進(jìn)展[J]. 鄭義,李超,王乃馨.  食品科學(xué). 2010(17)
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[7]金針菇多糖對(duì)環(huán)磷酰胺的增效減毒作用[J]. 袁強(qiáng),陳芝蕓,嚴(yán)茂祥.  中國(guó)中藥雜志. 2005(12)
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[9]金針菇研究概況[J]. 于榮利,秦旭升,宋鳳菊.  食用菌學(xué)報(bào). 2004(04)
[10]12種常見(jiàn)食用蘑菇脂肪酸絕對(duì)含量的測(cè)定[J]. 劉江琴,莫麗兒,莊海旗.  廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào). 2000(02)

博士論文
[1]根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的靈芝遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及其在靈芝三萜生物合成研究中的應(yīng)用[D]. 師亮.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012



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