枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）（2n=2x=34）屬于薔薇科枇杷屬植物,是我國南方的主要果樹之一,其中枇杷非整倍體對其遺傳育種研究具有重要意義。在生物體中,不同基因劑量之間存在微妙而敏感的平衡。通常,整倍體不會改變?nèi)旧w類型或基因的相對劑量。而非整倍體染色體之間的相對劑量是不平衡。非整倍體通常具有特定于分子核型的新表型。當(dāng)前,檢測植物非整倍體分子核型的技術(shù)較少,部分現(xiàn)有的技術(shù)成本較高,程序也較為繁瑣。因此,建立一種快速、簡便的枇杷非整倍體分子核型檢測技術(shù)十分必要。為此,基于非整倍體染色體之間相對劑量的不平衡,本研究開發(fā)了一種新方法用于枇杷非整倍體分子核型的檢測,命名為“基于SSR分子標(biāo)記和qPCR組合（SSR-qPCR）的枇杷非整倍體檢測方法”。該方法在三倍體枇杷后代中進(jìn)行了應(yīng)用,為枇杷非整倍體的快速檢測和分子核型的構(gòu)建提供了技術(shù)支撐。主要試驗結(jié)果如下:1、qPCR引物的篩選（1）以23個不同倍性枇杷株系（品種）（包括22個整倍體和1個非整倍體H39）的基因組DNA為模板,對209對SSR引物進(jìn)行PCR擴增,篩出無多態(tài)性且擴增穩(wěn)定的SSR引物17對,該17... 

【文章來源】：西南大學(xué)重慶市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：115 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

一個QF-PCR標(biāo)記的四個結(jié)果[136]

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文8程序可以在同一反應(yīng)管中對50個不同靶基因同時進(jìn)行檢測。整個流程是首先進(jìn)行探針雜交，然后進(jìn)行靶序列探針特異性序列連接，最后進(jìn)行PCR擴增和毛細(xì)管電泳檢測。近年來，MLPA已廣泛應(yīng)用在染色體遺傳疾并甲基化分析檢測等領(lǐng)域[151]。當(dāng)然，MLPA技術(shù)也存在一些局限性，單個目標(biāo)序列需同時設(shè)計長短探針，其中的長探針制備較復(fù)雜，另外需核酸雜交，操作比較繁瑣而且費時。（4）微陣列比較基因組雜交比較基因組雜交技術(shù)（comparativegenomichybridization，CGH）由Kallioniemi[139]于1992年首次建立，近些年來，又提出了微陣列比較基因組雜交技術(shù)（microarray-basedcomparativegenomichybridization，array-CGH）。array-CGH技術(shù)的整個流程是首先將等量不同熒光標(biāo)記的待測DNA和參照DNA分別雜交于分布有標(biāo)準(zhǔn)全基因組寡核苷酸探針的微陣列上，再經(jīng)過掃描儀掃描以及軟件分析比較，最終判斷待測樣本基因組拷貝數(shù)的變化（圖1-2）。目前主要應(yīng)用于人類的腫瘤發(fā)生和發(fā)育畸形等與染色體不平衡相關(guān)的研究[140]。該方法可以克服傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)核型分析的局限性，只需一次實驗即可對樣本在整個基因組的拷貝數(shù)變化進(jìn)行檢測。圖1-2常規(guī)CGH與array-CGH的原理圖[152]Fig.1-2SchematicdiagramofconventionalCGHandarray-CGH

第1章文獻(xiàn)綜述9（5）單核苷酸多態(tài)性微陣列2006年，Peiffer首次將高密度SNP基因分型技術(shù)引入到基因組圖譜中[153]，單核苷酸多態(tài)性微陣列（singlenucleotidepolymorphismarray，SNParray）僅需對待測樣本DNA進(jìn)行檢測，并與一整套正常基因組對照進(jìn)行比較即能獲得診斷結(jié)果。使用array-CGH技術(shù)可以較好的檢出CNV，相比之下SNParray除能檢出CNV外，還可以檢出大部分的單親二倍體、三倍體和一定水平的嵌合體[154-155]。目前，SNParray已逐漸推廣應(yīng)用于臨床診斷和產(chǎn)前診斷。當(dāng)然，SNParray存在以下局限性[156]：（1）由于芯片設(shè)計限制，SNParray并不能檢出全部已知綜合癥相關(guān)位點的異常，因此SNParray尚不能完全取代傳統(tǒng)的核型分析；（2）不能檢測出四倍體；（3）低比例嵌合體的檢出取決于樣本類型、平臺種類、DNA質(zhì)量、數(shù)據(jù)質(zhì)量等因素；（4）不能檢出平衡易位。（6）實時熒光定量PCR實時熒光定量PCR（quantitativereal-timepolymerasechainreaction，qPCR）也被廣泛應(yīng)用于非整倍體的檢測[142,157-159]。qPCR的原理是分別針對對照樣本染色體上的序列（通常為管家基因序列，發(fā)生數(shù)目異常的概率極小）和待檢測染色體上的序列設(shè)計不同引物。通過對擴增后兩個目標(biāo)序列對應(yīng)的Ct值或ΔRn值的比較進(jìn)而判斷染色體數(shù)目異常情況。如圖1-3，為執(zhí)行內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)以實現(xiàn)相對定量。在診斷給定21號染色體的三體時，可以選擇其他常染色體的特異性序列作為參照，在qPCR的指數(shù)增長期（假設(shè)CT=20），三體的ΔRn1值為（2+1）*220，而常染色體的ΔRn2值為2*220，ΔRn1/ΔRn2=1.5，進(jìn)而判斷其為三體（圖1-3）。圖1-3qPCR檢測非整倍體示意圖Fig.1-3DetectionofaneuploidyusingqPCR

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]大果無核紅肉枇杷新品種‘華金無核1號’[J]. 黨江波,郭啟高,向素瓊,何橋,孫海艷,吳頔,景丹龍,王淑明,夏燕,李曉林,梁國魯.  園藝學(xué)報. 2019(S2)
[2]大果紅肉抗病枇杷新品種‘金華3號’[J]. 黨江波,郭啟高,向素瓊,何橋,孫海燕,吳頔,景丹龍,王淑明,夏燕,李曉林,梁國魯.  園藝學(xué)報. 2019(S2)
[3]大果無核枇杷新品種‘華玉無核1號’[J]. 黨江波,郭啟高,向素瓊,何橋,孫海燕,吳頔,景丹龍,王淑明,夏燕,李曉林,梁國魯.  園藝學(xué)報. 2019(S2)
[4]少核高糖紅肉枇杷新品種‘金華2號’[J]. 黨江波,郭啟高,向素瓊,何橋,孫海燕,吳頔,景丹龍,王淑明,夏燕,李曉林,梁國魯.  園藝學(xué)報. 2019(S2)
[5]枇杷功能成分及生物活性研究進(jìn)展[J]. 劉麗麗,劉玉垠,王杰,趙小娜,魯周民.  食品科學(xué). 2020(05)
[6]Genomic selection methods for crop improvement:Current status and prospects[J]. Xin Wang,Yang Xu,Zhongli Hu,Chenwu Xu.  The Crop Journal. 2018(04)
[7]四倍體巨峰系葡萄有核栽培花果管理技術(shù)[J]. 陳錦永,程大偉,顧紅,張威遠(yuǎn),郭西智,張洋,祁帥.  果農(nóng)之友. 2018(05)
[8]枇杷葉片發(fā)育基因EjGRF5與啟動子克隆及其在不同倍性枇杷中的表達(dá)[J]. 劉超,王玲利,吳頔,黨江波,尚維,郭啟高,梁國魯.  中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2018(08)
[9]植物非整倍體研究進(jìn)展[J]. 朱斌,田貴福,賀路英,李再云.  廣西植物. 2018(10)
[10]VIGS誘導(dǎo)PSY基因沉默對枇杷果實類胡蘿卜素積累的影響[J]. 洪敏,石絲,何珊珊,文露,池卓恒,唐月明,王永清.  分子植物育種. 2018(06)

博士論文
[1]基于SSR標(biāo)記的枇杷遺傳多樣性分析與品種鑒別[D]. 何橋.西南大學(xué) 2010

碩士論文
[1]三倍體枇杷實生后代及雜交后代SCoT標(biāo)記及DNA甲基化分析[D]. 賈志剛.西南大學(xué) 2011
[2]枇杷高頻率體胚發(fā)生體系的建立及其遺傳轉(zhuǎn)化初步研究[D]. 沈慶斌.福建農(nóng)林大學(xué) 2005



本文編號：3252476