基于SSR分子標記及qPCR枇杷非整倍體分子核型分析體系的建立
發(fā)布時間：2021-06-27 08:11
枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）（2n=2x=34）屬于薔薇科枇杷屬植物,是我國南方的主要果樹之一,其中枇杷非整倍體對其遺傳育種研究具有重要意義。在生物體中,不同基因劑量之間存在微妙而敏感的平衡。通常,整倍體不會改變染色體類型或基因的相對劑量。而非整倍體染色體之間的相對劑量是不平衡。非整倍體通常具有特定于分子核型的新表型。當前,檢測植物非整倍體分子核型的技術較少,部分現(xiàn)有的技術成本較高,程序也較為繁瑣。因此,建立一種快速、簡便的枇杷非整倍體分子核型檢測技術十分必要。為此,基于非整倍體染色體之間相對劑量的不平衡,本研究開發(fā)了一種新方法用于枇杷非整倍體分子核型的檢測,命名為“基于SSR分子標記和qPCR組合（SSR-qPCR）的枇杷非整倍體檢測方法”。該方法在三倍體枇杷后代中進行了應用,為枇杷非整倍體的快速檢測和分子核型的構建提供了技術支撐。主要試驗結果如下:1、qPCR引物的篩選（1）以23個不同倍性枇杷株系（品種）（包括22個整倍體和1個非整倍體H39）的基因組DNA為模板,對209對SSR引物進行PCR擴增,篩出無多態(tài)性且擴增穩(wěn)定的SSR引物17對,該17...
【文章來源】：西南大學重慶市 211工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數】：115 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
一個QF-PCR標記的四個結果[136]
西南大學碩士學位論文8程序可以在同一反應管中對50個不同靶基因同時進行檢測。整個流程是首先進行探針雜交，然后進行靶序列探針特異性序列連接，最后進行PCR擴增和毛細管電泳檢測。近年來，MLPA已廣泛應用在染色體遺傳疾并甲基化分析檢測等領域[151]。當然，MLPA技術也存在一些局限性，單個目標序列需同時設計長短探針，其中的長探針制備較復雜，另外需核酸雜交，操作比較繁瑣而且費時。（4）微陣列比較基因組雜交比較基因組雜交技術（comparativegenomichybridization，CGH）由Kallioniemi[139]于1992年首次建立，近些年來，又提出了微陣列比較基因組雜交技術（microarray-basedcomparativegenomichybridization，array-CGH）。array-CGH技術的整個流程是首先將等量不同熒光標記的待測DNA和參照DNA分別雜交于分布有標準全基因組寡核苷酸探針的微陣列上，再經過掃描儀掃描以及軟件分析比較，最終判斷待測樣本基因組拷貝數的變化（圖1-2）。目前主要應用于人類的腫瘤發(fā)生和發(fā)育畸形等與染色體不平衡相關的研究[140]。該方法可以克服傳統(tǒng)細胞學核型分析的局限性，只需一次實驗即可對樣本在整個基因組的拷貝數變化進行檢測。圖1-2常規(guī)CGH與array-CGH的原理圖[152]Fig.1-2SchematicdiagramofconventionalCGHandarray-CGH
第1章文獻綜述9（5）單核苷酸多態(tài)性微陣列2006年，Peiffer首次將高密度SNP基因分型技術引入到基因組圖譜中[153]，單核苷酸多態(tài)性微陣列（singlenucleotidepolymorphismarray，SNParray）僅需對待測樣本DNA進行檢測，并與一整套正�；蚪M對照進行比較即能獲得診斷結果。使用array-CGH技術可以較好的檢出CNV，相比之下SNParray除能檢出CNV外，還可以檢出大部分的單親二倍體、三倍體和一定水平的嵌合體[154-155]。目前，SNParray已逐漸推廣應用于臨床診斷和產前診斷。當然，SNParray存在以下局限性[156]：（1）由于芯片設計限制，SNParray并不能檢出全部已知綜合癥相關位點的異常，因此SNParray尚不能完全取代傳統(tǒng)的核型分析；（2）不能檢測出四倍體；（3）低比例嵌合體的檢出取決于樣本類型、平臺種類、DNA質量、數據質量等因素；（4）不能檢出平衡易位。（6）實時熒光定量PCR實時熒光定量PCR（quantitativereal-timepolymerasechainreaction，qPCR）也被廣泛應用于非整倍體的檢測[142,157-159]。qPCR的原理是分別針對對照樣本染色體上的序列（通常為管家基因序列，發(fā)生數目異常的概率極小）和待檢測染色體上的序列設計不同引物。通過對擴增后兩個目標序列對應的Ct值或ΔRn值的比較進而判斷染色體數目異常情況。如圖1-3，為執(zhí)行內部標準以實現(xiàn)相對定量。在診斷給定21號染色體的三體時，可以選擇其他常染色體的特異性序列作為參照，在qPCR的指數增長期（假設CT=20），三體的ΔRn1值為（2+1）*220，而常染色體的ΔRn2值為2*220，ΔRn1/ΔRn2=1.5，進而判斷其為三體（圖1-3）。圖1-3qPCR檢測非整倍體示意圖Fig.1-3DetectionofaneuploidyusingqPCR
【參考文獻】：
期刊論文
[1]大果無核紅肉枇杷新品種‘華金無核1號’[J]. 黨江波,郭啟高,向素瓊,何橋,孫海艷,吳頔,景丹龍,王淑明,夏燕,李曉林,梁國魯. 園藝學報. 2019(S2)
[2]大果紅肉抗病枇杷新品種‘金華3號’[J]. 黨江波,郭啟高,向素瓊,何橋,孫海燕,吳頔,景丹龍,王淑明,夏燕,李曉林,梁國魯. 園藝學報. 2019(S2)
[3]大果無核枇杷新品種‘華玉無核1號’[J]. 黨江波,郭啟高,向素瓊,何橋,孫海燕,吳頔,景丹龍,王淑明,夏燕,李曉林,梁國魯. 園藝學報. 2019(S2)
[4]少核高糖紅肉枇杷新品種‘金華2號’[J]. 黨江波,郭啟高,向素瓊,何橋,孫海燕,吳頔,景丹龍,王淑明,夏燕,李曉林,梁國魯. 園藝學報. 2019(S2)
[5]枇杷功能成分及生物活性研究進展[J]. 劉麗麗,劉玉垠,王杰,趙小娜,魯周民. 食品科學. 2020(05)
[6]Genomic selection methods for crop improvement:Current status and prospects[J]. Xin Wang,Yang Xu,Zhongli Hu,Chenwu Xu. The Crop Journal. 2018(04)
[7]四倍體巨峰系葡萄有核栽培花果管理技術[J]. 陳錦永,程大偉,顧紅,張威遠,郭西智,張洋,祁帥. 果農之友. 2018(05)
[8]枇杷葉片發(fā)育基因EjGRF5與啟動子克隆及其在不同倍性枇杷中的表達[J]. 劉超,王玲利,吳頔,黨江波,尚維,郭啟高,梁國魯. 中國農業(yè)科學. 2018(08)
[9]植物非整倍體研究進展[J]. 朱斌,田貴福,賀路英,李再云. 廣西植物. 2018(10)
[10]VIGS誘導PSY基因沉默對枇杷果實類胡蘿卜素積累的影響[J]. 洪敏,石絲,何珊珊,文露,池卓恒,唐月明,王永清. 分子植物育種. 2018(06)
博士論文
[1]基于SSR標記的枇杷遺傳多樣性分析與品種鑒別[D]. 何橋.西南大學 2010
碩士論文
[1]三倍體枇杷實生后代及雜交后代SCoT標記及DNA甲基化分析[D]. 賈志剛.西南大學 2011
[2]枇杷高頻率體胚發(fā)生體系的建立及其遺傳轉化初步研究[D]. 沈慶斌.福建農林大學 2005
本文編號：3252476
【文章來源】：西南大學重慶市 211工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數】：115 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
一個QF-PCR標記的四個結果[136]
西南大學碩士學位論文8程序可以在同一反應管中對50個不同靶基因同時進行檢測。整個流程是首先進行探針雜交，然后進行靶序列探針特異性序列連接，最后進行PCR擴增和毛細管電泳檢測。近年來，MLPA已廣泛應用在染色體遺傳疾并甲基化分析檢測等領域[151]。當然，MLPA技術也存在一些局限性，單個目標序列需同時設計長短探針，其中的長探針制備較復雜，另外需核酸雜交，操作比較繁瑣而且費時。（4）微陣列比較基因組雜交比較基因組雜交技術（comparativegenomichybridization，CGH）由Kallioniemi[139]于1992年首次建立，近些年來，又提出了微陣列比較基因組雜交技術（microarray-basedcomparativegenomichybridization，array-CGH）。array-CGH技術的整個流程是首先將等量不同熒光標記的待測DNA和參照DNA分別雜交于分布有標準全基因組寡核苷酸探針的微陣列上，再經過掃描儀掃描以及軟件分析比較，最終判斷待測樣本基因組拷貝數的變化（圖1-2）。目前主要應用于人類的腫瘤發(fā)生和發(fā)育畸形等與染色體不平衡相關的研究[140]。該方法可以克服傳統(tǒng)細胞學核型分析的局限性，只需一次實驗即可對樣本在整個基因組的拷貝數變化進行檢測。圖1-2常規(guī)CGH與array-CGH的原理圖[152]Fig.1-2SchematicdiagramofconventionalCGHandarray-CGH
第1章文獻綜述9（5）單核苷酸多態(tài)性微陣列2006年，Peiffer首次將高密度SNP基因分型技術引入到基因組圖譜中[153]，單核苷酸多態(tài)性微陣列（singlenucleotidepolymorphismarray，SNParray）僅需對待測樣本DNA進行檢測，并與一整套正�；蚪M對照進行比較即能獲得診斷結果。使用array-CGH技術可以較好的檢出CNV，相比之下SNParray除能檢出CNV外，還可以檢出大部分的單親二倍體、三倍體和一定水平的嵌合體[154-155]。目前，SNParray已逐漸推廣應用于臨床診斷和產前診斷。當然，SNParray存在以下局限性[156]：（1）由于芯片設計限制，SNParray并不能檢出全部已知綜合癥相關位點的異常，因此SNParray尚不能完全取代傳統(tǒng)的核型分析；（2）不能檢測出四倍體；（3）低比例嵌合體的檢出取決于樣本類型、平臺種類、DNA質量、數據質量等因素；（4）不能檢出平衡易位。（6）實時熒光定量PCR實時熒光定量PCR（quantitativereal-timepolymerasechainreaction，qPCR）也被廣泛應用于非整倍體的檢測[142,157-159]。qPCR的原理是分別針對對照樣本染色體上的序列（通常為管家基因序列，發(fā)生數目異常的概率極小）和待檢測染色體上的序列設計不同引物。通過對擴增后兩個目標序列對應的Ct值或ΔRn值的比較進而判斷染色體數目異常情況。如圖1-3，為執(zhí)行內部標準以實現(xiàn)相對定量。在診斷給定21號染色體的三體時，可以選擇其他常染色體的特異性序列作為參照，在qPCR的指數增長期（假設CT=20），三體的ΔRn1值為（2+1）*220，而常染色體的ΔRn2值為2*220，ΔRn1/ΔRn2=1.5，進而判斷其為三體（圖1-3）。圖1-3qPCR檢測非整倍體示意圖Fig.1-3DetectionofaneuploidyusingqPCR
【參考文獻】：
期刊論文
[1]大果無核紅肉枇杷新品種‘華金無核1號’[J]. 黨江波,郭啟高,向素瓊,何橋,孫海艷,吳頔,景丹龍,王淑明,夏燕,李曉林,梁國魯. 園藝學報. 2019(S2)
[2]大果紅肉抗病枇杷新品種‘金華3號’[J]. 黨江波,郭啟高,向素瓊,何橋,孫海燕,吳頔,景丹龍,王淑明,夏燕,李曉林,梁國魯. 園藝學報. 2019(S2)
[3]大果無核枇杷新品種‘華玉無核1號’[J]. 黨江波,郭啟高,向素瓊,何橋,孫海燕,吳頔,景丹龍,王淑明,夏燕,李曉林,梁國魯. 園藝學報. 2019(S2)
[4]少核高糖紅肉枇杷新品種‘金華2號’[J]. 黨江波,郭啟高,向素瓊,何橋,孫海燕,吳頔,景丹龍,王淑明,夏燕,李曉林,梁國魯. 園藝學報. 2019(S2)
[5]枇杷功能成分及生物活性研究進展[J]. 劉麗麗,劉玉垠,王杰,趙小娜,魯周民. 食品科學. 2020(05)
[6]Genomic selection methods for crop improvement:Current status and prospects[J]. Xin Wang,Yang Xu,Zhongli Hu,Chenwu Xu. The Crop Journal. 2018(04)
[7]四倍體巨峰系葡萄有核栽培花果管理技術[J]. 陳錦永,程大偉,顧紅,張威遠,郭西智,張洋,祁帥. 果農之友. 2018(05)
[8]枇杷葉片發(fā)育基因EjGRF5與啟動子克隆及其在不同倍性枇杷中的表達[J]. 劉超,王玲利,吳頔,黨江波,尚維,郭啟高,梁國魯. 中國農業(yè)科學. 2018(08)
[9]植物非整倍體研究進展[J]. 朱斌,田貴福,賀路英,李再云. 廣西植物. 2018(10)
[10]VIGS誘導PSY基因沉默對枇杷果實類胡蘿卜素積累的影響[J]. 洪敏,石絲,何珊珊,文露,池卓恒,唐月明,王永清. 分子植物育種. 2018(06)
博士論文
[1]基于SSR標記的枇杷遺傳多樣性分析與品種鑒別[D]. 何橋.西南大學 2010
碩士論文
[1]三倍體枇杷實生后代及雜交后代SCoT標記及DNA甲基化分析[D]. 賈志剛.西南大學 2011
[2]枇杷高頻率體胚發(fā)生體系的建立及其遺傳轉化初步研究[D]. 沈慶斌.福建農林大學 2005
本文編號：3252476
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