月季是世界第一大切花,乙烯是影響花朵衰老的重要因素�；钚匝鯊V泛參與衰老信號傳遞,同樣在花朵衰老過程中起到關鍵作用。然而,乙烯到活性氧之間的信號傳遞途徑尚不明確。篩選和鑒定響應乙烯并調控活性氧水平的轉錄因子,成為解析乙烯調控月季花朵衰老分子機理的一個重要課題。我們在前人的月季花瓣乙烯響應基因表達譜的基礎上,通過芯片數據分析、半定量PCR和熒光定量PCR檢測,篩選出了響應乙烯并在月季花朵衰老過程中表達變化明顯的基因7個。在普通煙草中進行過表達實驗,結果表明,和轉基因空載相比,編號為RU03393和RU03429兩個基因過表達后,導致SOD酶活性顯著下降。利用病毒誘導的基因沉默（VIGS）技術在月季花瓣中進行了RU03393和RU03429的基因沉默實驗,根據花瓣表型觀察和SOD酶活性、離子滲透率、可溶性蛋白含量等生理指標測定,表明沉默RU03393和RU03429都延緩了月季花瓣的衰老。而在月季花瓣中過表達RU03393和RU03429則明顯加快了月季花瓣的衰老。相關研究結果初步了解乙烯-轉錄因子-抗氧化酶之間的信號傳遞機制,為解析乙烯對月季花朵衰老的調控機理奠定一定基礎。 

【文章來源】：華中農業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數】：62 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖1月季花瓣內響應乙烯明顯的基因表達譜

Ｆｉｇ．２?Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｃｈａｎｇｅ?ｏｆ?ｃａｎｄｉｄａｔｅ?ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ?ｆａｃｔｏｒ?ｉｎ?Ｃｈｉｎｅｓｅ?ｒｏｓｅ?ｐｅｔａｌｓ??３．３候選轉錄因子基因在月季花朵衰老過程中的表達分析??取正常開放的月季花朵０－６級，采用熱硼酸法提取花瓣總ＲＮＡ，并逆轉錄??得到ｃＤＮＡ模板。前期篩選的１２個候選轉錄因子基因，除去未克隆出來的和課題組??其他成員在做的，只剩下ＲＵ０３３９３、ＲＵ０３４２９和ＲＵ４９７７８，后期再根據前人的月季??花瓣內響應乙烯的基因表達譜數據，篩選出了?４個未知類型但乙烯處理后表達明顯??上調的轉錄因子ＲＵ０６８２９、ＲＵ００８９３、ＲＵ２３３１０和ＲＵ２５５０４。根據候選轉錄因子基??因全長設計引物，以ＲｈＡｃｔｉｎ５為內參基因，以開放級數０級的花瓣為對照，進行熒??光定量ＰＣＲ，檢測候選基因在月季花朵衰老過程中的表達變化。??

游為Ｋｐｎｌ）為引物組合，用高保真酶擴增出候選轉錄因子基因的ｃＤＮＡ全長片段。??回收純化后，使用限制性內切酶Ｓｗａｌ、Ｋｐｎｌ分別雙酶切回收片段和植物雙元表達??載體Ｓｕｐｅｒｌ３００?（載體圖如圖４）。酶切回收后用Ｔ４連接酶連接，并通過熱激法轉??入大腸桿菌Ｔｒａｎｓ５ａ感受態(tài)細胞中，進行ＰＣＲ檢測以及測序鑒定得到過表達載體質??粒。??一??——參思??—Ｔ????Ｔ?？〇ｒｔｆ＞ｒ?｜ｎｇＮ）??ｐＣＡｉ？Ａ１３００＊?｜Ｔ?？??＝遇?一－ｆ??一?，，??ＪＴ?Ｔ??ｐｔ？Ｕ２ｂ〇ｍ??圖４過表達載體ｓｕｐｅｒｌ３００載體圖??Ｆｉｇ．４?Ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｖｅｃｔｏｒ?ｓｕｐｅｒ?１３００??３４??

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本文編號：3242572