月季是世界第一大切花,乙烯是影響花朵衰老的重要因素�；钚匝鯊V泛參與衰老信號傳遞,同樣在花朵衰老過程中起到關(guān)鍵作用。然而,乙烯到活性氧之間的信號傳遞途徑尚不明確。篩選和鑒定響應(yīng)乙烯并調(diào)控活性氧水平的轉(zhuǎn)錄因子,成為解析乙烯調(diào)控月季花朵衰老分子機(jī)理的一個(gè)重要課題。我們在前人的月季花瓣乙烯響應(yīng)基因表達(dá)譜的基礎(chǔ)上,通過芯片數(shù)據(jù)分析、半定量PCR和熒光定量PCR檢測,篩選出了響應(yīng)乙烯并在月季花朵衰老過程中表達(dá)變化明顯的基因7個(gè)。在普通煙草中進(jìn)行過表達(dá)實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,和轉(zhuǎn)基因空載相比,編號為RU03393和RU03429兩個(gè)基因過表達(dá)后,導(dǎo)致SOD酶活性顯著下降。利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）技術(shù)在月季花瓣中進(jìn)行了RU03393和RU03429的基因沉默實(shí)驗(yàn),根據(jù)花瓣表型觀察和SOD酶活性、離子滲透率、可溶性蛋白含量等生理指標(biāo)測定,表明沉默RU03393和RU03429都延緩了月季花瓣的衰老。而在月季花瓣中過表達(dá)RU03393和RU03429則明顯加快了月季花瓣的衰老。相關(guān)研究結(jié)果初步了解乙烯-轉(zhuǎn)錄因子-抗氧化酶之間的信號傳遞機(jī)制,為解析乙烯對月季花朵衰老的調(diào)控機(jī)理奠定一定基礎(chǔ)。 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖1月季花瓣內(nèi)響應(yīng)乙烯明顯的基因表達(dá)譜

Ｆｉｇ．２?Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｃｈａｎｇｅ?ｏｆ?ｃａｎｄｉｄａｔｅ?ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ?ｆａｃｔｏｒ?ｉｎ?Ｃｈｉｎｅｓｅ?ｒｏｓｅ?ｐｅｔａｌｓ??３．３候選轉(zhuǎn)錄因子基因在月季花朵衰老過程中的表達(dá)分析??取正常開放的月季花朵０－６級，采用熱硼酸法提取花瓣總ＲＮＡ，并逆轉(zhuǎn)錄??得到ｃＤＮＡ模板。前期篩選的１２個(gè)候選轉(zhuǎn)錄因子基因，除去未克隆出來的和課題組??其他成員在做的，只剩下ＲＵ０３３９３、ＲＵ０３４２９和ＲＵ４９７７８，后期再根據(jù)前人的月季??花瓣內(nèi)響應(yīng)乙烯的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，篩選出了?４個(gè)未知類型但乙烯處理后表達(dá)明顯??上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子ＲＵ０６８２９、ＲＵ００８９３、ＲＵ２３３１０和ＲＵ２５５０４。根據(jù)候選轉(zhuǎn)錄因子基??因全長設(shè)計(jì)引物，以ＲｈＡｃｔｉｎ５為內(nèi)參基因，以開放級數(shù)０級的花瓣為對照，進(jìn)行熒??光定量ＰＣＲ，檢測候選基因在月季花朵衰老過程中的表達(dá)變化。??

游為Ｋｐｎｌ）為引物組合，用高保真酶擴(kuò)增出候選轉(zhuǎn)錄因子基因的ｃＤＮＡ全長片段。??回收純化后，使用限制性內(nèi)切酶Ｓｗａｌ、Ｋｐｎｌ分別雙酶切回收片段和植物雙元表達(dá)??載體Ｓｕｐｅｒｌ３００?（載體圖如圖４）。酶切回收后用Ｔ４連接酶連接，并通過熱激法轉(zhuǎn)??入大腸桿菌Ｔｒａｎｓ５ａ感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行ＰＣＲ檢測以及測序鑒定得到過表達(dá)載體質(zhì)??粒。??一??——參思??—Ｔ????Ｔ?？〇ｒｔｆ＞ｒ?｜ｎｇＮ）??ｐＣＡｉ？Ａ１３００＊?｜Ｔ?？??＝遇?一－ｆ??一?，，??ＪＴ?Ｔ??ｐｔ？Ｕ２ｂ〇ｍ??圖４過表達(dá)載體ｓｕｐｅｒｌ３００載體圖??Ｆｉｇ．４?Ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｖｅｃｔｏｒ?ｓｕｐｅｒ?１３００??３４??

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號：3242572