鹽漬土是限制蘋果果樹生長的主要環(huán)境因素之一,嚴重影響我國果樹的生產(chǎn)和發(fā)展。通過長期進化,植物形成了一系列的耐鹽脅迫機制。其中,陽離子/質(zhì)子轉(zhuǎn)運載體在維持細胞內(nèi)的離子平衡方面起到關(guān)鍵作用。Na⁺/H⁺交換蛋白在維持細胞內(nèi)低濃度的Na⁺以避免離子毒害的過程中發(fā)揮重要作用。質(zhì)膜定位的SOS1交換蛋白,通過經(jīng)典的Salt-overly-sensitive（SOS）途徑,介導Na⁺向胞外的流出。定位于液泡上的Na⁺/H⁺交換蛋白,能夠?qū)a⁺隔離到液泡內(nèi),降低Na⁺對胞質(zhì)中細胞器的毒害作用。但是,目前,對于液泡上的Na⁺/H⁺交換蛋白的調(diào)控機制研究相對較少。作為光合作用的主要產(chǎn)物,糖類不僅是植物體主要能量物質(zhì),也為脂類、蛋白質(zhì)和核酸的合成提供碳骨架,在植物的生長發(fā)育過程中具有重要作用。此外,糖類還是植物應對鹽脅迫的主要細胞滲透調(diào)節(jié)劑之一。近年來,通過遺傳學、細胞生物學和一系列的功... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學山東省

【文章頁數(shù)】：124 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
符號說明
中文摘要
英文摘要
1 前言
    1.1 土壤鹽漬化及其危害
    1.2 植物耐鹽機制
        1.2.1 積累滲透調(diào)節(jié)物
        1.2.2 活性氧清除機制
        1.2.3 離子平衡
        1.2.4 SOS(Salt-Overly-Sensitive)途徑
        1.2.5 Na~+/H~+交換蛋白與植物耐鹽性
            1.2.5.1 Na~+/H~+交換蛋白(NHX)的分類
            1.2.5.2 Na~+/H~+交換蛋白的生化功能和調(diào)控
    1.3 植物中的糖感知與糖信號
        1.3.1 植物中的糖信號的產(chǎn)生
        1.3.2 植物中的糖感知機制
            1.3.2.1 葡萄糖感受器HXK
            1.3.2.2 二糖的感知
            1.3.2.3 細胞表面受體與糖信號
        1.3.3 植物中的糖信號轉(zhuǎn)導
            1.3.3.1 轉(zhuǎn)錄調(diào)控
            1.3.3.2 蛋白激酶和蛋白磷酸酶在糖信號轉(zhuǎn)導中的作用
        1.3.4 糖信號與植物激素
            1.3.4.1 糖信號與ABA信號
            1.3.4.2 糖信號與乙烯信號
    1.4 研究的目的與意義
2 材料與方法
    2.1 試驗材料
        2.1.1 蘋果材料
        2.1.2 擬南芥及其生長條件
        2.1.3 酵母及其生長條件
        2.1.4 菌株
        2.1.5 載體
        2.1.6 引物
        2.1.7 所用藥品試劑
        2.1.8 培養(yǎng)基
        2.1.9 緩沖液配方
    2.2 試驗方法
        2.2.1 植物總RNA的提取
        2.2.2 RNA含量與純度檢測
        2.2.3 基因組DNA的去除
        2.2.4 基因的克隆
        2.2.5 PCR產(chǎn)物回收
        2.2.6 連接反應
        2.2.7 大腸桿菌感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化
        2.2.8 測序
        2.2.9 質(zhì)粒DNA的提取
        2.2.10 質(zhì)粒DNA的酶切反應
        2.2.11 表達載體的構(gòu)建
            2.2.11.1 MdHXK1、MdNHX1過量表達載體的構(gòu)建
            2.2.11.2 MdHXK1、MdNHX1瞬時沉默表達載體的構(gòu)建
            2.2.11.3 用于發(fā)根農(nóng)桿菌侵染的pK7GWIWG2載體構(gòu)建
            2.2.11.4 啟動子載體構(gòu)建
            2.2.11.5 原核表達載體的構(gòu)建
            2.2.11.6 酵母雙雜交載體構(gòu)建
        2.2.12 農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化
        2.2.13 植物材料的準備及轉(zhuǎn)化
            2.2.13.1 蘋果王林愈傷組織的培養(yǎng)
            2.2.13.2 蘋果愈傷組織的轉(zhuǎn)化
            2.2.13.3 ‘Gala’蘋果遺傳轉(zhuǎn)化
            2.2.13.4 發(fā)根農(nóng)桿菌MSU440侵染
        2.2.14 酵母雙雜
            2.2.14.1 所用相關(guān)試劑及配制方法
            2.2.14.2 酵母雙雜交步驟
        2.2.15 蛋白相關(guān)的試驗技術(shù)
            2.2.15.1 原核誘導蛋白
            2.2.15.2 原核誘導蛋白純化
            2.2.15.3 Pull-Down
            2.2.15.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)
        2.2.16 植物總蛋白的提取
        2.2.17 蛋白免疫印跡分析(Westernblotting)
            2.2.17.1 轉(zhuǎn)膜
            2.2.17.2 洗膜和顯影
        2.2.18 蛋白體外降解
        2.2.19 Co-IP免疫共沉淀
        2.2.20 蛋白磷酸化檢測
            2.2.20.1 離體蛋白磷酸化的鑒定(放射性32P同位素標記)
            2.2.20.2 體內(nèi)蛋白磷酸化的檢測(Pro-QDiamondPhosphoproteinGelStain)
        2.2.21 蘋果原生質(zhì)體的提取
            2.2.21.1 原生質(zhì)體的分離
            2.2.21.2 PEG轉(zhuǎn)化
        2.2.22 Na~+/H~+交換活性檢測
            2.2.22.1 液泡膜蛋白的提取
            2.2.22.2 測定Na~+/H~+交換活性
        2.2.23 酵母突變體互補試驗
        2.2.24 脯氨酸含量測定
            2.2.24.1 脯氨酸的提取
            2.2.24.2 脯氨酸標準曲線
        2.2.25 MDA含量測定
        2.2.26 Na~+、K+離子含量測定
3 結(jié)果與分析
    3.1 外源葡萄糖提高蘋果苗的耐鹽性
        3.1.1 外源葡萄糖提高蘋果苗的耐鹽性
        3.1.2 葡萄糖提高蘋果苗耐鹽性依賴于HXK
    3.2 葡萄糖通過MdHXK1提高蘋果耐鹽性
        3.2.1 MdHXK1在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均受鹽脅迫的誘導
        3.2.2 反義抑制MdHXK1的表達降低蘋果葉片的耐鹽性
        3.2.3 MdHXK1主要依賴其信號途徑提高耐鹽性
    3.3 MdHXK1與MdNHX1互作
        3.3.1 MdHXK1互作蛋白的篩選
        3.3.2 MdHXK1與MdNHX1互作驗證
    3.4 MdNHX1的功能鑒定
        3.4.1 MdNHX1基因的分子克隆
        3.4.2 酵母突變體互補驗證Na~+/H~+交換蛋白MdNHX1的功能
        3.4.3 MdNHX1的亞細胞定位
        3.4.4 MdNHX1基因的表達模式分析
        3.4.5 過表達MdNHX1提高蘋果愈傷的耐鹽性
        3.4.6 MdNHX1過表達蘋果愈傷中的Na~+/H~+交換活性提高
        3.4.7 異源表達MdNHX1提高擬南芥的耐鹽性
    3.5 MdHXK1在275位的絲氨酸磷酸化MdNHX1蛋白
    3.6 MdHXK1影響MdNHX1的蛋白穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)運活性
        3.6.1 MdHXK1提高MdNHX1的蛋白穩(wěn)定性
        3.6.2 MdHXK1提高MdNHX1的轉(zhuǎn)運活性
        3.6.3 共轉(zhuǎn)MdHXK1與MdNHX1提高酵母突變體的耐鹽性
    3.7 MdHXK1提高植物耐鹽性部分依賴于MdNHX
        3.7.1 MdHXK1提高蘋果愈傷耐鹽性
        3.7.2 過表達MdHXK1提高蘋果植株的耐鹽性
        3.7.3 MdHXK1提高蘋果苗的耐鹽性部分依賴MdNHX
        3.7.4 反義抑制MdNHX1的表達增加了MdHXK1過表達植株葉片對鹽的敏感性
4 討論
    4.1 葡萄糖信號通過HXK依賴途徑提高耐鹽性
    4.2 MdHXK1部分通過MdNHX1參與植物耐鹽性
    4.3 MdNHX1在維持鹽脅迫下細胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)過程中起重要作用
5 結(jié)論
6 參考文獻
7 附錄
8 致謝
9 攻讀學位期間發(fā)表論文情況


【參考文獻】：
期刊論文
[1]中國蘋果主產(chǎn)區(qū)生產(chǎn)布局變遷及影響因素分析[J]. 劉天軍,范英.  農(nóng)業(yè)經(jīng)濟問題. 2012(10)
[2]當今世界蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展趨勢及我國蘋果產(chǎn)業(yè)優(yōu)質(zhì)高效發(fā)展意見[J]. 陳學森,韓明玉,蘇桂林,劉鳳之,過國南,姜遠茂,毛志泉,彭福田,束懷瑞.  果樹學報. 2010(04)
[3]土壤水鹽運移模型研究進展[J]. 郭瑞,馮起,司建華,常宗強,席海洋,劉蔚.  冰川凍土. 2008(03)



本文編號：3232356