菊花（Chrysanthemum grandiflorum Ramat.）是世界四大鮮切花之一,觀賞和經(jīng)濟(jì)價值極高,但切花菊周年生產(chǎn)過程中,普遍存在土壤鹽漬化問題,嚴(yán)重影響切花產(chǎn)量與品質(zhì)。WRKY轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)各種非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。本研究以鹽脅迫下’神馬’菊花葉片為實驗材料,采用IlluminaHiSeqTM2000雙末端測序技術(shù)對菊花進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息分析,克隆得到1個WRKY基因并遺傳轉(zhuǎn)化’神馬’菊花,為通過分子生物學(xué)手段提高栽培菊花的耐鹽性提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1.利用鹽脅迫下菊花葉片為材料建立cDNA文庫,采用Illumina HiSeqTM 2000系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,共獲得有效序列0.94億條,平均長度94.37 bp。序列經(jīng)組裝得到365323個長度大于100 bp的轉(zhuǎn)錄本,進(jìn)一步拼接后,共獲得161522條Unigenes。161522條Unigenes全部被比對到公共數(shù)據(jù)庫中,其中比對到GO和KOG數(shù)據(jù)庫的Unigenes分別為12153和23477條,共有25173條Unigenes被KEGG注釋參與到306個pathway中,然后根據(jù)差異表達(dá)基因... 

【文章來源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 植物耐鹽基因的研究概況和發(fā)展趨勢
        1.1.1 滲透調(diào)節(jié)相關(guān)基因
        1.1.2 抗氧化脅迫相關(guān)基因
        1.1.3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因
        1.1.4 編碼抗脅迫轉(zhuǎn)錄因子的基因
    1.2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究
        1.2.1 WRKY轉(zhuǎn)錄因子概述
        1.2.2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物非生物脅迫中的作用
    1.3 轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的研究
        1.3.1 轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)概述
        1.3.2 新一代轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的應(yīng)用
        1.3.3 轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在植物鹽脅迫響應(yīng)基因篩選中的應(yīng)用
    1.4 研究內(nèi)容及日的意義
    1.5 技術(shù)路線
2 菊花轉(zhuǎn)錄組測序
    2.1 實驗材料
        2.1.1 植物材料與預(yù)處理
        2.1.2 實驗設(shè)備儀器
        2.1.3 實驗試劑
    2.2 實驗方法
        2.2.1 菊花總RNA的提取與檢測
        2.2.2 cDNA文庫的制備與上機(jī)測序
        2.2.3 序列組裝
        2.2.4 基因功能注釋
        2.2.5 差異基因分析
        2.2.6 Quantitative Real-time PCR (qPCR)驗證
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 轉(zhuǎn)錄組序列組裝及分析
        2.3.2 轉(zhuǎn)錄本的功能注釋
        2.3.3 與菊花鹽脅迫響應(yīng)有關(guān)的差異表達(dá)基因
        2.3.4 qPCR驗證結(jié)果分析
3 WRKY2基因的克隆和對菊花的遺傳轉(zhuǎn)化
    3.1 實驗材料
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 實驗儀器
        3.1.3 實驗主要試劑和菌株
        3.1.4 引物序列
    3.2 實驗方法
        3.2.1 菊花總RNA的提取與檢測
        3.2.2 cDNA的合成和gDNA去除
        3.2.3 引物設(shè)計與PCR擴(kuò)增
        3.2.4 PCR產(chǎn)物的檢測與膠回收
        3.2.5 PCR回收產(chǎn)物的連接轉(zhuǎn)化
        3.2.6 基因序列分析
        3.2.7 菊花DgWRKY2基因表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.2.8 農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備
        3.2.9 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞
        3.2.10 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化菊花
        3.2.11 轉(zhuǎn)基因陽性植株的鑒定
        3.2.12 轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 DgWRKY2全長的獲得
        3.3.2 DgWRKY2基因的序列分析
        3.3.3 DgWRKY2蛋白的生物信息學(xué)分析
        3.3.4 DgWRKY2蛋白的同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹分析
        3.3.5 轉(zhuǎn)基因植株的獲得及表達(dá)水平
        3.3.6 DgWRKY2過表達(dá)菊花植株的表型觀察
4 DgWRKY2基因的耐鹽性評價
    4.1 實驗材料
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 實驗設(shè)備儀器
        4.1.3 實驗試劑
    4.2 實驗方法
        4.2.1 鹽脅迫處理
        4.2.2 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因菊花的生理指標(biāo)測定
        4.2.3 氮藍(lán)四唑(NBT)和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色
        4.2.4 DgWRKY2相關(guān)耐鹽調(diào)控基因在鹽脅迫處理下的表達(dá)分析
        4.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 鹽脅迫下菊花幼苗生理生化特性的變化
        4.3.2 DgWRKY2相關(guān)耐鹽調(diào)控基因在鹽脅迫處理下的表達(dá)分析
5 討論
    5.1 鹽脅迫下菊花轉(zhuǎn)錄組信息分析
        5.1.1 鹽脅迫下菊花差異表達(dá)基因的篩選與分析
        5.1.2 調(diào)節(jié)菊花耐鹽性的轉(zhuǎn)錄因子
    5.2 DgWRKY2的獲得與生物信息學(xué)分析
    5.3 轉(zhuǎn)DgWRKY2基因菊花耐鹽機(jī)理探討
    5.4 DgWRKY2基因在鹽脅迫應(yīng)答過程中參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
6 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3184465