香蕉是熱帶亞熱帶重要的經濟作物,在香蕉的生長過程中,許多因素限制了其生長,甚至導致大量減產,例如香蕉葉斑病和香蕉枯萎病。因此,研究生物脅迫對香蕉影響的分子機理對香蕉抵抗生物脅迫有非常重要的理論意義,為今后抗病育種提供了良好的基礎。鈣依賴蛋白激酶基因（CDPK）在抵抗病原菌侵染的過程中起到了重要的作用。本研究根據本實驗室積累的工作,在已獲得的MaCDPK4基因全長的基礎之上,通過構建植物過表達載體轉入煙草探究其功能;構建酵母雙雜交誘餌載體,篩選與其互作的蛋白,取得結果如下:（1）構建了酵母雙雜交誘餌載體pGBKT-7-MaCDPK4,轉入酵母菌AH109進行自激活與毒性檢測,在SD/-Trp/X-α-Gal,SD/-Ade/-His/-Trp/X-α-Gal固體培養(yǎng)基中并未發(fā)現藍色菌斑,表明其無法自激活,在SD/-Trp固體培養(yǎng)基中,帶空載體與帶重組質粒的菌落生長情況一致,表明無毒性,適合進行酵母雙雜交下一步實驗。（2）構建了香蕉受香蕉枯萎病菌生理小種4號（FOC4）侵染后根的cDNA文庫,將其與誘餌載體,文庫載體共轉入酵母菌AH109中進行酵母雙雜交,將可能的陽性克隆測序,得到的片段進... 

【文章來源】：海南大學海南省 211工程院校

【文章頁數】：50 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 香蕉的概念及所受災害
        1.1.1 香蕉簡介
        1.1.2 香蕉植株豐富的生物多樣性
        1.1.3 香蕉枯萎病災害
    1.2 鈣依賴蛋白激酶概念概述
        1.2.1 鈣依賴蛋白激酶概念
        1.2.2 CDPK結構與調控
        1.2.3 CDPK的表達與定位
        1.2.4 底物特異性
    1.3 CDPKs功能的研究進展
        1.3.1 CDPKs在免疫信號途徑中被微生物病原體激活
        1.3.2 CDPKs在過氧化與細胞死亡中的作用
        1.3.3 對食草動物攻擊與受傷的響應
        1.3.4 CDPKs調控ABA基因的表達和參與干旱和鹽脅迫信號途徑
        1.3.5 CDPKs在干旱與鹽脅迫信號途徑中的代謝和轉運調控
        1.3.6 調控氣孔的活動
        1.3.7 低溫耐性
    1.4 本研究的目的和意義
    1.5 技術路線
2 材料與方法
    2.1 材料與試劑
        2.1.1 材料
        2.1.2 試劑
        2.1.3 所需引物
        2.1.4 所用儀器
    2.2 步驟與方法
        2.2.1 MaCDPK4酵母雙雜交誘餌載體的構建和自激活及毒性檢測
            2.2.1.1 PCR擴增MaCDPK4
            2.2.1.2 PCR產物純化回收和酶切連接
            2.2.1.3 質粒轉化大腸桿菌和擴增
            2.2.1.4 重組質粒pGBKT-7-MaCDPK4的鑒定
            2.2.1.5 酵母感受態(tài)細胞的制備
            2.2.1.6 重組質粒pGBKT-7-MaCDPK4的自激活及毒性檢測
        2.2.2 香蕉在FOC4侵染后根的cDNA文庫的構建
            2.2.2.1 香蕉在FOC4侵染后根的總RNA的提取
            2.2.2.2 cDNA第一鏈的合成
            2.2.2.3 雙鏈cDNA的合成
            2.2.2.4 純化柱純化雙鏈cDNA
        2.2.3 酵母雙雜交及陽性克隆的篩選與驗證
            2.2.3.1 酵母感受態(tài)的制備
            2.2.3.2 酵母共轉化篩選pGBKT-7-MaCDPK4相互作用分子
            2.2.3.3 提取酵母菌質粒及PCR鑒定與測序
            2.2.3.4 互作蛋白基因的載體構建
            2.2.3.5 酵母雙雜交驗證互作
        2.2.4 香蕉CDPK4基因過表達載體的構建及遺傳轉化
            2.2.4.1 構建重組質粒PVKH-MaCDPK4
            2.2.4.2 農桿菌感受態(tài)的制備
            2.2.4.3 轉化農桿菌
            2.2.4.4 農桿菌介導的遺傳轉化
        2.2.5 轉基因煙草的篩選及鑒定
            2.2.5.1 煙草葉片基因組DNA的提取
            2.2.5.2 轉基因T1代植株PCR擴增檢測
            2.2.5.3 潮霉素篩選培養(yǎng)基篩選T1代種子
            2.2.5.4 轉基因煙草T2代的分子鑒定
        2.2.6 FOC4處理對轉基因煙草生長的影響和煙草基因的表達分析
            2.2.6.1 FOC4處理煙草幼苗
            2.2.6.2 煙草幼苗根的熒光檢測
            2.2.6.3 FOC4處理下煙草基因的表達分析
3 結果與分析
    3.1 誘餌載體pGBKT-7-MaCDPK4的構建及其自激活及毒性檢測
        3.1.1 誘餌載體pGBKT-7-MaCDPK4的酶切及PCR檢測
        3.1.2 自激活及毒性檢測
    3.2 FOC4處理的香蕉根系cDNA文庫的構建及純化與檢測
        3.2.1 提取FOC4處理下香蕉根的總RNA
        3.2.2 香蕉根cDNA文庫的構建及純化與檢測
    3.3 酵母雙雜交
    3.4 陽性克隆的篩選及驗證
        3.4.1 陽性克隆的篩選
        3.4.2 互作蛋白基因載體的構建
        3.4.3 酵母雙雜交互作驗證
    3.5 MaCDPK4植物表達載體的構建及檢測
    3.6 植物表達載體轉入農桿菌
    3.7 轉基因煙草
        3.7.1 T1抗性苗篩選
        3.7.2 轉基因煙草的PCR檢測
        3.7.3 轉基因煙草的RT-PCR檢測
        3.7.4 T2代轉基因煙草潮霉素篩選
        3.7.5 T3代轉基因煙草純合株系的獲得
    3.8 FOC4處理下轉基因煙草的表型及相關抗病基因的表達分析
        3.8.1 FOC4處理下轉基因煙草的表型
        3.8.2 FOC4處理下煙草根的顯微鏡下觀察
        3.8.3 FOC4處理下相關抗病基因的表達分析
4 討論
    4.1 MaCDPK4轉基因煙草對香蕉枯萎病菌抵抗能力增強
    4.2 酵母雙雜交獲得與MaCDPK4互作的蛋白
5 結論
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3165799