香蕉是熱帶亞熱帶重要的經(jīng)濟(jì)作物,在香蕉的生長過程中,許多因素限制了其生長,甚至導(dǎo)致大量減產(chǎn),例如香蕉葉斑病和香蕉枯萎病。因此,研究生物脅迫對香蕉影響的分子機(jī)理對香蕉抵抗生物脅迫有非常重要的理論意義,為今后抗病育種提供了良好的基礎(chǔ)。鈣依賴蛋白激酶基因（CDPK）在抵抗病原菌侵染的過程中起到了重要的作用。本研究根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室積累的工作,在已獲得的MaCDPK4基因全長的基礎(chǔ)之上,通過構(gòu)建植物過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入煙草探究其功能;構(gòu)建酵母雙雜交誘餌載體,篩選與其互作的蛋白,取得結(jié)果如下:（1）構(gòu)建了酵母雙雜交誘餌載體pGBKT-7-MaCDPK4,轉(zhuǎn)入酵母菌AH109進(jìn)行自激活與毒性檢測,在SD/-Trp/X-α-Gal,SD/-Ade/-His/-Trp/X-α-Gal固體培養(yǎng)基中并未發(fā)現(xiàn)藍(lán)色菌斑,表明其無法自激活,在SD/-Trp固體培養(yǎng)基中,帶空載體與帶重組質(zhì)粒的菌落生長情況一致,表明無毒性,適合進(jìn)行酵母雙雜交下一步實(shí)驗(yàn)。（2）構(gòu)建了香蕉受香蕉枯萎病菌生理小種4號（FOC4）侵染后根的cDNA文庫,將其與誘餌載體,文庫載體共轉(zhuǎn)入酵母菌AH109中進(jìn)行酵母雙雜交,將可能的陽性克隆測序,得到的片段進(jìn)... 

【文章來源】：海南大學(xué)海南省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：50 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 香蕉的概念及所受災(zāi)害
        1.1.1 香蕉簡介
        1.1.2 香蕉植株豐富的生物多樣性
        1.1.3 香蕉枯萎病災(zāi)害
    1.2 鈣依賴蛋白激酶概念概述
        1.2.1 鈣依賴蛋白激酶概念
        1.2.2 CDPK結(jié)構(gòu)與調(diào)控
        1.2.3 CDPK的表達(dá)與定位
        1.2.4 底物特異性
    1.3 CDPKs功能的研究進(jìn)展
        1.3.1 CDPKs在免疫信號途徑中被微生物病原體激活
        1.3.2 CDPKs在過氧化與細(xì)胞死亡中的作用
        1.3.3 對食草動(dòng)物攻擊與受傷的響應(yīng)
        1.3.4 CDPKs調(diào)控ABA基因的表達(dá)和參與干旱和鹽脅迫信號途徑
        1.3.5 CDPKs在干旱與鹽脅迫信號途徑中的代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控
        1.3.6 調(diào)控氣孔的活動(dòng)
        1.3.7 低溫耐性
    1.4 本研究的目的和意義
    1.5 技術(shù)路線
2 材料與方法
    2.1 材料與試劑
        2.1.1 材料
        2.1.2 試劑
        2.1.3 所需引物
        2.1.4 所用儀器
    2.2 步驟與方法
        2.2.1 MaCDPK4酵母雙雜交誘餌載體的構(gòu)建和自激活及毒性檢測
            2.2.1.1 PCR擴(kuò)增MaCDPK4
            2.2.1.2 PCR產(chǎn)物純化回收和酶切連接
            2.2.1.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌和擴(kuò)增
            2.2.1.4 重組質(zhì)粒pGBKT-7-MaCDPK4的鑒定
            2.2.1.5 酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備
            2.2.1.6 重組質(zhì)粒pGBKT-7-MaCDPK4的自激活及毒性檢測
        2.2.2 香蕉在FOC4侵染后根的cDNA文庫的構(gòu)建
            2.2.2.1 香蕉在FOC4侵染后根的總RNA的提取
            2.2.2.2 cDNA第一鏈的合成
            2.2.2.3 雙鏈cDNA的合成
            2.2.2.4 純化柱純化雙鏈cDNA
        2.2.3 酵母雙雜交及陽性克隆的篩選與驗(yàn)證
            2.2.3.1 酵母感受態(tài)的制備
            2.2.3.2 酵母共轉(zhuǎn)化篩選pGBKT-7-MaCDPK4相互作用分子
            2.2.3.3 提取酵母菌質(zhì)粒及PCR鑒定與測序
            2.2.3.4 互作蛋白基因的載體構(gòu)建
            2.2.3.5 酵母雙雜交驗(yàn)證互作
        2.2.4 香蕉CDPK4基因過表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化
            2.2.4.1 構(gòu)建重組質(zhì)粒PVKH-MaCDPK4
            2.2.4.2 農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備
            2.2.4.3 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
            2.2.4.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化
        2.2.5 轉(zhuǎn)基因煙草的篩選及鑒定
            2.2.5.1 煙草葉片基因組DNA的提取
            2.2.5.2 轉(zhuǎn)基因T1代植株P(guān)CR擴(kuò)增檢測
            2.2.5.3 潮霉素篩選培養(yǎng)基篩選T1代種子
            2.2.5.4 轉(zhuǎn)基因煙草T2代的分子鑒定
        2.2.6 FOC4處理對轉(zhuǎn)基因煙草生長的影響和煙草基因的表達(dá)分析
            2.2.6.1 FOC4處理煙草幼苗
            2.2.6.2 煙草幼苗根的熒光檢測
            2.2.6.3 FOC4處理下煙草基因的表達(dá)分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 誘餌載體pGBKT-7-MaCDPK4的構(gòu)建及其自激活及毒性檢測
        3.1.1 誘餌載體pGBKT-7-MaCDPK4的酶切及PCR檢測
        3.1.2 自激活及毒性檢測
    3.2 FOC4處理的香蕉根系cDNA文庫的構(gòu)建及純化與檢測
        3.2.1 提取FOC4處理下香蕉根的總RNA
        3.2.2 香蕉根cDNA文庫的構(gòu)建及純化與檢測
    3.3 酵母雙雜交
    3.4 陽性克隆的篩選及驗(yàn)證
        3.4.1 陽性克隆的篩選
        3.4.2 互作蛋白基因載體的構(gòu)建
        3.4.3 酵母雙雜交互作驗(yàn)證
    3.5 MaCDPK4植物表達(dá)載體的構(gòu)建及檢測
    3.6 植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌
    3.7 轉(zhuǎn)基因煙草
        3.7.1 T1抗性苗篩選
        3.7.2 轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測
        3.7.3 轉(zhuǎn)基因煙草的RT-PCR檢測
        3.7.4 T2代轉(zhuǎn)基因煙草潮霉素篩選
        3.7.5 T3代轉(zhuǎn)基因煙草純合株系的獲得
    3.8 FOC4處理下轉(zhuǎn)基因煙草的表型及相關(guān)抗病基因的表達(dá)分析
        3.8.1 FOC4處理下轉(zhuǎn)基因煙草的表型
        3.8.2 FOC4處理下煙草根的顯微鏡下觀察
        3.8.3 FOC4處理下相關(guān)抗病基因的表達(dá)分析
4 討論
    4.1 MaCDPK4轉(zhuǎn)基因煙草對香蕉枯萎病菌抵抗能力增強(qiáng)
    4.2 酵母雙雜交獲得與MaCDPK4互作的蛋白
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[3]鈣與葉銹菌侵染誘導(dǎo)小麥防衛(wèi)反應(yīng)的關(guān)系[J]. 侯春燕,王智炘,王冬梅.  華北農(nóng)學(xué)報(bào). 2007(01)
[4]影響Ca2+代謝和鈣通道的藥物對小麥?zhǔn)苋~銹菌侵染后誘發(fā)的HR的作用[J]. 關(guān)春蕾,侯春燕,王冬梅.  河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2006(06)
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本文編號：3165799