發(fā)布時(shí)間：2021-01-12 10:35

　　芒果（Mangifera indica L.）是僅次于香蕉的熱帶、亞熱帶水果之一,由膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.&Sacc）引起芒果炭疽病是為害芒果最嚴(yán)重的病害之一。關(guān)于該病害的研究,在病害癥狀、病原菌生物學(xué)、病害發(fā)生規(guī)律和防治方法等方面報(bào)道較多,但在致病機(jī)理及其致病性相關(guān)基因方面的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)研究了該菌為調(diào)控黑色素合成相關(guān)的兩個(gè)致病基因小柱孢酮脫水酶SCD1基因和羥基萘還原酶基因THR1,在克隆獲得了全長(zhǎng)序列的基礎(chǔ)上,通過(guò)插入gfp::hygB替換靶標(biāo)基因的原理構(gòu)建了敲除載體,通過(guò)轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體、含hygB的SR平板篩選、特異性引物PCR驗(yàn)證獲得SCD1基因和THR1基因各3個(gè)敲除突變體,測(cè)定了表型初步分析了其功能,這對(duì)揭示Cgloeosporioides. 的致病機(jī)理具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值,也為后續(xù)尋求防治該病害的新靶標(biāo)打下良好的理論基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:1.獲得芒果炭疽病菌小柱孢酮脫水酶基因SCD1全長(zhǎng)DNA和cDNA序列參照橡膠樹(shù)炭疽病菌HBCg01基因組數(shù)據(jù),利用同源克隆策略技術(shù),通過(guò)PCR和RT-PCR技術(shù),獲得S... 

【文章來(lái)源】：海南大學(xué)海南省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：86 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖２ｐＣＴ７４質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖??Ｆｉ．２?ＰｌａｓｍｉｄｅＣＴ７４??

插入ｐＵＣ?１９載體的Ｔ－Ｃｌｏｎｉｎｇ克隆位點(diǎn)上，后轉(zhuǎn)化￡■．〇？／／?ＤＨ?５ａ，篩選出陽(yáng)性克??隆測(cè)序，將序列正確的克隆提取質(zhì)粒、并用７０％的甘油保存，即完成了?ＳＣＤ／和??７７／及７基因敲除載體的構(gòu)建（圖３）。??５ＳＣＤ１?＋?ａｔｏ：：ｈｖａＢ?｜＾＞－ｆ?３ＳＣＤ１??ｌｎ－Ｆｕｓｉｏｎ？！ＨＤ?Ｃｌｏｎｉｎｇ?Ｋｉｔ??ｐＵＣ１９＂Ｔ?一｜?Ｔ－Ｃｌｏｎｉｎｇ?Ｓｉｔｅ?￣［—??ＰＡ２ＳＣＤ１ＧＨ?ｘｌ?丄?Ｋ?，＿，???［］５ＳＣＤ１?＜?Ｑｆｐ：：ｈｖ〇Ｂ?＞?３ＳＣＤ１?｜?｜???圖３．?ＳＣＯ／基因敲除載體的構(gòu)建策略（７７／７？／同）??Ｆｉｇ．３?Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ?ｖｅｃｔｏｒ?ｏｆ?ＳＣＤ１?ｇｅｎｅ?ｉｎ?Ｃ．?ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ??（１）＞ＳＣＤ７基因５＇端和３＇端片段的擴(kuò)增與回收??根據(jù)己獲得的全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)引物，以Ａ２ｇＤＮＡ為模板，擴(kuò)增靠近??ＳＣＤ］基因５＇端含啟動(dòng)子在內(nèi)預(yù)期大小約５００ｂｐ的一段序列５ＳＣＤ１，同時(shí)擴(kuò)增??靠近ＳＣＤ１基因３＇附近序列長(zhǎng)３５０ｂｐ的一段序列３ＳＣＤ１。??引物序列如下：（邊框部分序列為與ｐＵＣ１９載體同源的序列；單線部分與??片段同源的序列，下同）??基因５＇端擴(kuò)增引物：??５ＳＣＤ１－ＭＦ：?５，?＾ＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＧＡＴ（＾?ＣＣＣＡＣＧＴＣＣＣＴＴＧＣＡＧＴＡ－３ｒ??５ＳＣＤ１－ＭＲ：?５

２．?１．２沉仍基因的ＤＮＡ、ｃＤＮＡ片段？廣增及序列分析??（１）?■ＳＣＺＷ基因的ＤＮＡ片段擴(kuò)增以膠胞炭疽菌Ａ２的總ＤＮＡ為模版，??用引物ＳＣＤ１Ｑ－Ｆ／Ｒ擴(kuò)增獲得了約１６００ｂｐ的片段（圖６），測(cè)序表明大小為??１５８０ｂｐ；在ＮＣＢＩ?ＧｅｎｅＢａｎｋ中與已提交的基因序列進(jìn)行Ｂｌａｓｔｎ相似性對(duì)比，結(jié)??果表明該序列與?Ｃ?ｃａｒ／ｃａｅ?（Ｇｅｎｂａｎｆｃ?ＧＱ２６６３８６．１＞?Ｃ．?／ｍｍ似（ＧＱ２６６３８９．１）及匸．??ｌａｇｅｎａｒｉｕｍ?（Ｄ８６０７９．１）＾?Ｃ．ｃｏｃｃｏｄｅｓ?（ＧＱ２６６３Ｓ５＼＼ｙ?Ｃ．ｆｌｏｒｉｎｉａｅ?（ＬＸＭ００７５９２２８６．１）??的小柱孢酮脫水酶基因相似性依次達(dá)９７％、９８％、８９％、８９％、８７％，可見(jiàn)本實(shí)??驗(yàn)試驗(yàn)所獲得的基因片段是預(yù)期的芒果炭疽菌小柱孢酮脫水酶基因沉：／）／，適合??進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。??２４??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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[2]玉米大斑病菌黑色素合成途徑相關(guān)基因的克隆及功能分析[D]. 曹志艷.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2009
[3]調(diào)控玉米大斑病菌生長(zhǎng)發(fā)育和致病性的STK基因的克隆與功能分析[D]. 谷守芹.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007

碩士論文
[1]芒果炭疽病菌漆酶基因Lac1的克隆與致病相關(guān)功能鑒定[D]. 韋運(yùn)謝.海南大學(xué) 2014
[2]杧果炭疽病菌對(duì)咪鮮胺的室內(nèi)抗藥性研究[D]. 王小琴.福建農(nóng)林大學(xué) 2013
[3]玉米大斑病菌漆酶基因StLAC在黑色素合成中的功能分析[D]. 詹旭.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
[4]玉米大斑病菌黑色素合成酶基因4HNR的克隆與功能研究[D]. 溫雷蕾.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008
[5]膠孢炭疽菌侵染柿樹(shù)的細(xì)胞學(xué)研究及CGTA1基因的克隆[D]. 李明江.浙江大學(xué) 2007
[6]篩選芒果采后炭疽病和蒂腐病的生防菌研究[D]. 何秀娟.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2006
[7]芒果炭疽菌遺傳基礎(chǔ)多態(tài)性研究[D]. 江華.華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué) 2004



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