本研究是為最終達(dá)成對(duì)海棠進(jìn)行精準(zhǔn)鑒定以及對(duì)全部海棠品種進(jìn)行系統(tǒng)分類這個(gè)大目標(biāo)而做出的初步分析和研究。本研究利用了SSR分子標(biāo)記技術(shù),對(duì)山東省內(nèi)海棠品種進(jìn)行了種質(zhì)的分離與鑒定。本研究通過(guò)從薔薇科蘋果屬(Malus)開發(fā)的引物中篩選出的18對(duì)SSR引物,對(duì)從山東濰坊昌邑海棠苗木專業(yè)合作社、山東省林業(yè)高科技創(chuàng)新園、山東省林業(yè)廳院內(nèi)、山東東營(yíng)利津縣王莊沙區(qū)林場(chǎng)、濟(jì)南軍區(qū)黃河三角洲綜合訓(xùn)練基地、以及山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林木種質(zhì)資源基地采集的96份海棠材料進(jìn)行種質(zhì)資源分離鑒定以及遺傳多樣性分析,得以從DNA角度對(duì)實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析并構(gòu)建指紋圖譜,為后續(xù)的保存海棠種質(zhì)、避免相同種質(zhì)的重復(fù)收集、新品種的培育進(jìn)化、規(guī)范海棠市場(chǎng)定名都有重要意義。通過(guò)實(shí)驗(yàn)與研究主要得到以下結(jié)果:1.對(duì)影響海棠SSR反應(yīng)體系的五個(gè)主要因素進(jìn)行了不同水平的優(yōu)化實(shí)驗(yàn),最終確立了海棠分子標(biāo)記的反應(yīng)體系為20μL:10μM前后引物各0.15μL,1μLDNA原液,10ng/μLDNA模板,0.5UTaqDNA聚合酶0.2μL,200μmol/L dNTP1.6μL,2.0 mmol/LMg Cl22μL,用重蒸水調(diào)整體系終體積為20μL。Touchdown PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s;Tm℃(引物各異),復(fù)性30 s;72℃延伸30s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。4℃低溫保存。2.從40對(duì)海棠SSR引物中篩選出18對(duì)穩(wěn)定性好、條帶清晰、有良好多態(tài)性的引物用于實(shí)驗(yàn)海棠樣品的遺傳多樣性分析。經(jīng)過(guò)毛細(xì)管電泳后的數(shù)據(jù)分析,得出18對(duì)高多態(tài)性海棠引物共檢出多態(tài)位點(diǎn)數(shù)228個(gè),多態(tài)位點(diǎn)檢出率為80.85%。從同一地點(diǎn)采集的樣品作為同一居群,所有樣品共視為六個(gè)居群進(jìn)行分析得到以下結(jié)果:實(shí)驗(yàn)海棠材料的平均觀察等位基因數(shù)(Na)為1.8085,平均有效等位基因數(shù)(Ne)為1.1544,平均Nei遺傳多樣指數(shù)(H)為0.1099,平均Shannon多樣性指數(shù)(I)為0.1920,總基因多樣性(Ht)平均值為0.1179,平均基因分化系數(shù)(Gst)0.2696。綜合分析海棠有較高的遺傳多樣性。3.通過(guò)結(jié)合遺傳系數(shù),配合海棠新品種的相關(guān)性狀,對(duì)96份海棠樣品材料進(jìn)行聚類分析,在遺傳系數(shù)處0.79-0.82處,分為了甜茶組、新雜交培育組、冬紅果組、山荊子組、沙果組、西府海棠組、湖北海棠組。并將新雜交培育組、山荊子組、沙果組根據(jù)親緣關(guān)系遠(yuǎn)近分別又分成了6、2、4個(gè)小組,以對(duì)采集海棠材料里的新培育品種進(jìn)行親緣關(guān)系遠(yuǎn)近區(qū)分。4.通過(guò)實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增結(jié)果,分析96個(gè)樣品,得到采集樣品實(shí)際為88份海棠種質(zhì)材料。在此基礎(chǔ)上,對(duì)篩選出的18對(duì)高多態(tài)性擴(kuò)增引物結(jié)合88份種質(zhì)構(gòu)建了海棠的指紋圖譜。其中僅CH02d08/Z71981/CH01c06/HI02F06/CH03G12這五個(gè)引物的組合鑒別效率就達(dá)到了全部種質(zhì)的86%,即通過(guò)5對(duì)引物就可以對(duì)76份海棠種質(zhì)進(jìn)行種質(zhì)分離鑒別。在下一步的研究中可以作為優(yōu)選引物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。另有8份種質(zhì)未能檢測(cè)出差異,是否為相同種質(zhì)或是未檢出差異還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。
【學(xué)位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S661.4
【部分圖文】：

圖 3-1 25-48 號(hào)海棠材料 DNA 檢測(cè)圖Figure 3-1 The results of DNAelectrophoresis of No.25-No.48 Malus materials圖 3-2 49-72 號(hào)海棠材料 DNA 檢測(cè)圖Figure 3-2 The results of DNAelectrophoresis of No.49-No.72 Malus materials 優(yōu)化海棠 SSR 反應(yīng)體系1 熒光引物 PCR 擴(kuò)增體系經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)不斷優(yōu)化，得到如表 3-1 海棠 PCR 反應(yīng)體系表 3-1 優(yōu)化后海棠 PCR 反應(yīng)體系組成Table3-1 Reaction system of Malus PCR after optimization

基于 SSR 分子標(biāo)記的海棠種質(zhì)資源分離與鑒定果與分析 DNA 濃度純度檢測(cè)檢測(cè) DNA 質(zhì)量時(shí)采用了瓊脂糖凝膠電泳法。瓊脂糖跑膠結(jié)果如圖，條帶清晰說(shuō)明 DNA 提取質(zhì)量較好，也可用于 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)的驗(yàn)證。圖 3-1 25-48 號(hào)海棠材料 DNA 檢測(cè)圖Figure 3-1 The results of DNAelectrophoresis of No.25-No.48 Malus materials

圖 3-3 引物 GD100 對(duì) 37-60 號(hào)海棠材料的擴(kuò)增檢驗(yàn)結(jié)果Figure 3-3 Amplification test result of primer GD100 for No. 37-No.60 Malus materialFigure 3-4 引物 Hi02f0OO6 對(duì) 37-60 號(hào)海棠材料的擴(kuò)增檢驗(yàn)結(jié)果圖 3-4 Amplification test result of primer Hi02f0OO6 for No. 37- No.60 Malus material細(xì)管電泳結(jié)果例分析：圖 3-5 為 7 號(hào)樣品在 CH2B12 位點(diǎn)的毛細(xì)管電泳峰值圖，顯示檢雜亂，但該樣品在其他位點(diǎn)，如圖 3-6 在位點(diǎn) NZ28f04 的峰值較為明顯，以圖 3-5 中除兩最高峰外其他視為無(wú)效峰。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2878932