蒙古白麗蘑Leucocalocybe mongolica(S.Imai)X.D.YuY.J.Yao原名蒙古口蘑Tricholoma mongolicum S.Imai,俗稱白蘑、口蘑,是東北亞地區(qū)久負(fù)盛名的野生珍稀食藥用菌,是蒙古高原的特有種。通常以蘑菇圈的形式生長在草原上。由于它的美味以及其強(qiáng)身健體、藥食同源的屬性,蒙古白麗蘑被當(dāng)?shù)鼐用窈蜕倘藗兟訆Z性的采集、出售,導(dǎo)致它的生境持續(xù)受到影響,資源日漸減少。蒙古白麗蘑的生存遭遇前所未有的威脅以及處于瀕臨滅絕的狀態(tài)。本文在野外調(diào)查的基礎(chǔ)之上,從生理學(xué)、遺傳學(xué)以及分子生態(tài)學(xué)角度探索如何保護(hù)瀕危的珍稀菌物物種,充分合理利用野生資源的問題。關(guān)于蒙古白麗蘑的系統(tǒng)學(xué)地位,作為目前白麗蘑屬的單種屬的唯一成員,對其形態(tài)特征和基因信息的研究是屬和種分類的關(guān)鍵。因?yàn)榍捌诘难芯績H涉及到LSU單一片段,而如今譜系一致的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)種識別法(GCPSR)作為一個(gè)重要的研究手段影響著真菌的分子系統(tǒng)學(xué)。我們實(shí)施了一個(gè)基于最大似然法的多基因聯(lián)合建樹的分析方案,三個(gè)核糖體DNA區(qū)域(LSU,SSU,ITS)和線粒體區(qū)域(mtSSU)被選擇用于對蒙古白麗蘑的分類學(xué)地位的界定。涉及到83份蕈菌樣本,結(jié)果顯示香蘑Lepista與蒙古白麗蘑在分子水平上存在較近的親緣關(guān)系,而香蘑屬Lepista和杯傘屬Clitocybe都是多系類群。生理學(xué)特性方面,首先,孢子萌發(fā)機(jī)制的問題,選擇5種培養(yǎng)基對蒙古白麗蘑孢子懸浮液的萌發(fā)狀況進(jìn)行了檢測,其中改良的孟加拉紅馬鈴薯培養(yǎng)基較利于孢子萌發(fā)。菌蓋的直徑與孢子萌發(fā)出菌落的數(shù)目呈現(xiàn)出正相關(guān)性。其次,核相的變化問題,采用熒光顯微鏡法觀察了其核相交替現(xiàn)象。再次是生物學(xué)特性的研究,野外采集到的擔(dān)子果經(jīng)組織分離獲取得到菌株,研究了其生物學(xué)特性,碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子單因素試驗(yàn)篩選每組最優(yōu)的三個(gè)因子,綜合菌絲日生長速率和生長勢,碳源選擇麥芽糖、淀粉和纖維二糖;氮源選擇酵母浸膏,牛肉粉,牛肉浸膏;無機(jī)鹽選擇K_2HPO_4,Fe_2(SO_4)_3以及不添加;生長因子選擇糙皮側(cè)耳煮汁、胡蘿卜煮汁、豆芽煮汁。對上述四個(gè)因素分別進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn),并確定了最佳菌絲生長條件。4個(gè)因素對正交體系的影響順序是生長因子無機(jī)鹽氮源碳源,方差齊性檢驗(yàn)展示了四個(gè)因子的極顯著差異性。菌絲營養(yǎng)生長最優(yōu)條件為淀粉、牛肉膏、2%的胡蘿卜煮汁、不添加無機(jī)鹽�；谡辉囼�(yàn)的優(yōu)化所得的培養(yǎng)基基礎(chǔ)之上研究其最佳溫度和初始pH值,其結(jié)果為pH=6.5和25℃。蒙古白麗蘑在全球分布中僅在有限的范圍內(nèi),由于特殊的棲息地,對其生理學(xué)研究具有必要性,實(shí)驗(yàn)顯示無機(jī)鹽和pH是影響菌絲生長的重要因素。蒙古白麗蘑的轉(zhuǎn)錄組和基因組方面,生物信息數(shù)據(jù)庫查詢不到相關(guān)數(shù)據(jù),制約了對其深入的研究�；诤喕蚪M的測序分析表明RAD-seq不適用于蒙古白麗蘑SSR的開發(fā)。特定的DNA條形碼像IGS1、ITS、RPB2和mtSSU在蒙古白麗蘑10個(gè)樣本之間沒有表現(xiàn)出理想的多態(tài)性。所以,實(shí)施了轉(zhuǎn)錄組從頭測序,轉(zhuǎn)錄本獲取的意義是為了促進(jìn)基因的發(fā)現(xiàn),了解活性物質(zhì)生物合成的生理機(jī)制,識別微衛(wèi)星位點(diǎn)以期作為探索蒙古白麗蘑遺傳多樣性的分子標(biāo)記。依托Illumina公司的末端配對測序法獲取42622958個(gè)clean data,拼接為37302個(gè)contigs,基于對已知蛋白質(zhì)的相似性搜索,13821個(gè)unigenes得到了較好的BLAST結(jié)果,對這些unigenes使用7個(gè)公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了注釋,6642個(gè)unigenes被注釋到基因本體數(shù)據(jù)庫(GO)的三個(gè)功能性分組即分子功能、生物過程、細(xì)胞組成。使用直系同源簇比對的(COG)方法對一些未知基因進(jìn)行預(yù)測,3914個(gè)unigenes被預(yù)測到25個(gè)COG分類項(xiàng)目中。4019個(gè)unigenes注釋到了KEGG通路數(shù)據(jù)庫,其中3110個(gè)在KEGG數(shù)據(jù)庫中較好的匹配,被分類于5個(gè)主要分組,包括35個(gè)KEGG通路,同時(shí)又識別出了57個(gè)涉及萜類、甾醇類、不飽和脂肪酸類生物合成通路中的基因,次生代謝產(chǎn)物引起了越來越多的關(guān)注,轉(zhuǎn)錄組注釋得到的活性物質(zhì)代謝合成途徑為建立了生化合成平臺提供了基礎(chǔ)性的研究數(shù)據(jù)。另外,對轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了碳水化合物酶數(shù)據(jù)庫的注釋,結(jié)果顯示總計(jì)446個(gè)碳水化合物酶相關(guān)的基因得以注釋,和其他已公布的有代表性生態(tài)類型的蕈菌相比,碳水化合物酶結(jié)合模塊(CBM)的數(shù)目相對其他蕈菌少,CE11、GT19、GT51、GT56、GH131、GH133、GH135在其他蕈菌中未被發(fā)現(xiàn),這些特征性的碳水化合物酶基因可能在蒙古白麗蘑的營養(yǎng)基物的代謝過程中扮演一個(gè)重要的角色�；诮M裝得到的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù),搜尋得到1860個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn),這些位點(diǎn)是蒙古白麗蘑候選分子標(biāo)記。蒙古白麗蘑遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)的研究方面,我們通過2015年7月到2017年9月七次實(shí)地采樣對蒙古白麗蘑主要分布地進(jìn)行資源調(diào)查,采樣范圍主要圍繞錫林郭勒草原、呼倫貝爾草原、貢格爾草原、張家口壩上草原四大草原區(qū)�；谵D(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù),90個(gè)EST-SSR引物使用eprimer3 v6.6.0程序進(jìn)行開發(fā),使用聚丙烯酰胺凝膠電泳分型技術(shù)從中搜尋出8個(gè)多態(tài)性高的引物對�；�8個(gè)多態(tài)性的微衛(wèi)星引物進(jìn)行毛細(xì)管電泳分型,獲取得到17個(gè)地理種群223個(gè)個(gè)體的402個(gè)等位基因。種群的等位基因數(shù)目從11到31個(gè),平均每個(gè)種群24個(gè),種群觀測雜合度(Ho)從0.300到0.875,期盼雜合度(He)0.188到0.621。分子方差分析(AMOVA)表明,14.19%的遺傳變異存在于種群之間(p0.001),而85.81%存在于種群內(nèi)。17個(gè)地理種群平均的遺傳分化系數(shù)F_(ST)為0.171,顯示在種群間較低的遺傳分化水平。曼特爾測試結(jié)果顯示種群的遺傳距離和地理距離缺乏顯著相關(guān)性(r=0.049,p=0.28)�；�8個(gè)微衛(wèi)星數(shù)據(jù)產(chǎn)生的UPGMA系統(tǒng)聚類圖顯示17個(gè)種群在0.8的Nei's相似性系數(shù)上分成了3個(gè)姐妹群。223個(gè)樣本基于貝葉斯算法進(jìn)行Structure分析,結(jié)果顯示三個(gè)血統(tǒng)起源,將三個(gè)血統(tǒng)譜系在17個(gè)地理種群的分布情況映射到的地圖坐標(biāo)中進(jìn)行可視化分析。17個(gè)種群的空間遺傳結(jié)構(gòu)使用AIS軟件中的IGLS程序進(jìn)行實(shí)現(xiàn)。綜合分析表明,生境特征與種群遺傳多樣性及其種群結(jié)構(gòu)有較大的相關(guān)性。另外,Barrier分析表明,整個(gè)分布區(qū)的南部區(qū)域(經(jīng)緯度范圍為43.2-45N,116.2E-118E)呈現(xiàn)出幾個(gè)空間上分割的片狀分布區(qū)。生境破碎化顯現(xiàn)出連續(xù)生境被破壞成幾個(gè)空間上遙遠(yuǎn)的斑塊分布,保持和豐富種群的遺傳多樣性是蒙古白麗蘑就地保育的關(guān)鍵。本研究獲得了種群結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性的數(shù)據(jù),將為保育措施的制定提供依據(jù)。就地保護(hù)時(shí),那些遺傳多樣性高的居群和區(qū)域應(yīng)列為優(yōu)先保護(hù)地區(qū),以最大限度地保護(hù)其遺傳多樣性。關(guān)于蒙古白麗蘑的開發(fā)利用方面,目前擔(dān)子果人工栽培技術(shù)缺乏實(shí)質(zhì)性的突破,發(fā)酵技術(shù)作為資源利用的集約化途徑極具前景。本文對液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵進(jìn)行了研究。液態(tài)發(fā)酵最優(yōu)的配方依次通過單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡坡度實(shí)驗(yàn)、響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行確定,其配方是蔗糖35.13 g/L、黃豆粉16.55 g/L、玉米漿粉33 g/L。在此基礎(chǔ)上優(yōu)化所得最佳培養(yǎng)條件為25℃、初始pH 6.5、120 rpm、裝液量75 mL/250 mL、接種量12.5%。為了篩選固態(tài)發(fā)酵的最佳基質(zhì),對玉米粒、麥粒等5種基質(zhì)進(jìn)行了篩選,結(jié)果顯示玉米粒是較優(yōu)良的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì),建立了玉米粒為主要基質(zhì)成分的固態(tài)發(fā)酵工藝流程。使用擔(dān)子果作為參照評估了兩種發(fā)酵方式的產(chǎn)物的營養(yǎng)成分、揮發(fā)性組分。GC-MS結(jié)果顯示21種揮發(fā)性成分可能是擔(dān)子果的呈味物質(zhì)。固態(tài)發(fā)酵前后的活性成分做了測定,檢測顯示黃酮類、多糖類、三萜類、甾醇類、酚類物質(zhì)的含量都相對發(fā)酵前較大程度的提高。蒙古白麗蘑固態(tài)發(fā)酵技術(shù)值得更深入的研究推廣。
【學(xué)位單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S646
【部分圖文】：

1.5 本文研究主要技術(shù)路線圖本文研究的主要技術(shù)路線圖見圖 1.1 所示，其在系統(tǒng)學(xué)地位確定的基礎(chǔ)之上，通過生理學(xué)、遺傳學(xué)、分子生態(tài)學(xué)的三個(gè)方面探索其致瀕機(jī)制，從而制定相應(yīng)的保育策略。最后，在保育的基礎(chǔ)之上，如何合理的、可持續(xù)性的利用蒙古白麗蘑資源，最大限度的發(fā)揮其社會經(jīng)濟(jì)學(xué)價(jià)值也是本文研究的初衷。

（ITS 區(qū)）片段 685 bp，線粒體小亞基（mtSSU 區(qū)）片段 806 bp，核糖體大 區(qū)）片段 1010 bp，核糖體小亞基 18s （SSU 區(qū)）片段 1481 bp。四片段進(jìn)行聯(lián)2 bp。對其進(jìn)行 DAMBE 飽和度分析，其分析結(jié)果如表 2-5 所示，其堿基替換飽圖 2.1 所示。ISS 小于 ISS.c 且 p=0.0000，表示序列替換未飽和是極其顯著的合建樹分析是可行的。表 2-5 DAMBE 的分析Tab.2-5 The analysis of DAMBEISS ISScSym T DF P ISScASym T DF 0.263 0.849 54.014 3882 0 0.838 52.966 3882 0.314 0.843 33.629 3882 0 0.760 28.375 3882 0.347 0.828 23.644 3882 0 0.670 15.906 3882 0.408 0.809 16.033 3882 0 0.556 5.909 3882 esting whether the observed Iss is significantly lower than Iss.cis Iss.c assuming a symmetrical topology. IssAsym is Iss.c assuming an asymmetrical topology.

圖 2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹簡化示意圖Fig.2.3 The Simplified schematic diagram of Phylogenetic tree
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2878183