龍眼(Dimocarpus longan Lour.)屬無患子科(Sapindaceae)龍眼屬,是著名的熱帶亞熱帶特色果樹。龍眼體細(xì)胞胚胎發(fā)生(somatic embryogenesis,SE)系統(tǒng)是研究龍眼胚胎發(fā)育的良好系統(tǒng)。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)參與可變切割、轉(zhuǎn)錄干擾、DNA甲基化調(diào)節(jié)和蛋白質(zhì)修飾,但對于lncRNAs在植物體胚發(fā)生過程中的研究還未見報(bào)道。在本研究中,以胚性愈傷組織(embryonic callus,EC)、不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)(Incomplete embryonic compact structure,ICpEC)、球形胚(globular embryo,GE)為試驗(yàn)材料,采用Ⅲumina HiSeq測序技術(shù)系統(tǒng)地鑒定了龍眼體胚發(fā)生早期3個(gè)階段的lncRNAs;對lncRNAs的差異顯著性分析結(jié)果,進(jìn)行篩選及表達(dá)分析;通過KEGG富集分析,構(gòu)建生長素、脫落酸與乙烯響應(yīng)因子相關(guān)的lncRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò),進(jìn)行龍眼SE早期以及在相應(yīng)激素處理下的表達(dá)分析,并對lncRNAs靶基因ERF相關(guān)的家族成員進(jìn)行鑒定;預(yù)測lncRNAs與miRNA的作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò),通過miRNA的過表達(dá)與抑制表達(dá)處理,使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)技術(shù)對其相關(guān)的lncRNAs與mRNAs進(jìn)行表達(dá)量驗(yàn)證;構(gòu)建lncRNAs的過表達(dá)載體,通過PEG轉(zhuǎn)化與農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入龍眼原生質(zhì)體與胚性愈傷組織。研究內(nèi)容主要如下:1龍眼體胚發(fā)生早期相關(guān)的lncRNAs的鑒定與靶基因預(yù)測采用Ⅲumina HiSeq測序技術(shù)對龍眼的3個(gè)樣本(EC、ICpEC與GE)進(jìn)行高通量測序,鑒定新型lncRNAs為7643個(gè),其中6005個(gè)檢測到表達(dá)。通過樣本間兩兩對比的差異表達(dá)lncRNAs發(fā)現(xiàn),在龍眼早期SE過程中,GE階段存在更多特異的lncRNAs,作用主要在ICpEC到GE階段。lncRNAs的功能主要通過cis或trans方式作用于靶基因來實(shí)現(xiàn),對lncRNAs差異顯著的靶基因進(jìn)行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),在EC vs.GE與ICpEC vs.GE中“植物-病原菌互作”與“植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”途徑最富集。2龍眼體胚發(fā)生早期lncRNAs及其靶基因的篩選與表達(dá)分析為了確定龍眼早期SE顯著差異lncRNAs的表達(dá),挑選了20個(gè)在RNA-Seq中表達(dá)量差異顯著lncRNAs以及5個(gè)與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的lncRNAs進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。除了LTCONS-00027337之外,其余24個(gè)lncRNAs均可以在EC、ICpEC與GE中檢測到表達(dá)。結(jié)果顯示,24個(gè)lncRNAs中有16個(gè)lncRNAs的RNA-Seq與qRT-PCR的表達(dá)趨勢一致。為進(jìn)一步了解“植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”途徑在龍眼體胚發(fā)生早期的作用,鑒定了其中6個(gè)關(guān)鍵的lncRNAs。在qRT-PCR中,6個(gè)lncRNA對其靶基因均為正調(diào)控關(guān)系,并且為順式調(diào)節(jié)的。推測與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的lncRNA主要在早期龍眼SE中起順式調(diào)控的作用。對lncRNAs靶基因ERF家族進(jìn)行系統(tǒng)地鑒定,并對5個(gè)在龍眼早期SE過程中富集的ERF基因進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)。結(jié)果進(jìn)一步表明,隨著龍眼早期SE進(jìn)行內(nèi)源激素等方面發(fā)生顯著變化,為了促進(jìn)胚胎的正常發(fā)育,需要更多的DlERF基因參與。通過對5個(gè)在龍眼早期SE差異顯著表達(dá)的DlERF基因進(jìn)行qRT-PCR與RNA-Seq表達(dá)結(jié)果對比發(fā)現(xiàn),大部分在龍眼早期SE 3個(gè)階段的表達(dá)趨勢一致,且其中3個(gè)DlERF基因在龍眼GE階段表達(dá)量最高。由此可見,從EC到GE階段需要更多的ERF基因來參與GE階段的維持,也進(jìn)一步說明在早期SE過程中,細(xì)胞分裂分化和抗性等方面也逐漸增強(qiáng)。使用不同濃度的外源激素處理龍眼胚性愈傷組織,從復(fù)雜的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中可以看出,作為植物激素相關(guān)的lncRNAs,在龍眼SE過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。3龍眼體胚發(fā)生早期lncRNAs與miRNAs調(diào)控關(guān)系除了與編碼蛋白相互作用外,lncRNAs也可能與miRNA相互作用。本試驗(yàn)預(yù)測了龍眼lncRNAs作為miRNA的前體、靶基因以及內(nèi)源誘捕靶標(biāo)(endogenous target mimic,eTM)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證在龍眼SE早期發(fā)育期間lncRNA、miRNA和mRNA之間的關(guān)系,對Dlo-miR172a、Dlo-miR159a.1和Dlo-miR398a的預(yù)測網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。通過對Dlo-miR172a、Dlo-miR159a.1和Dlo-miR398a過表達(dá)和抑制表達(dá)的樣品中表達(dá)量分析,我們發(fā)現(xiàn)了龍眼中早期SE期間Dlo-miR172a與其相關(guān)的lncRNA和mRNA具有與預(yù)測相同的表達(dá)趨勢。然而,DlomiR398a、Dlo-miR159a.1與其相關(guān)的mRNA和lncRNA之間的調(diào)節(jié)關(guān)系復(fù)雜,需要進(jìn)一步探索。4龍眼體胚發(fā)生早期lncRNAs的過表達(dá)載體構(gòu)建及瞬時(shí)表達(dá)本試驗(yàn)構(gòu)建了LTCONS-00042843與LTCONS-00006334的過表達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法與PEG轉(zhuǎn)化法,實(shí)現(xiàn)了LTCONS-00042843與LTCONS-00006334在龍眼原生質(zhì)體與愈傷組織中過表達(dá)。從qRT-PCR結(jié)果中看出,在原生質(zhì)體中,LTCONS-00042843與LTCONS-00006334及其靶基因均表現(xiàn)為顯著上升,也進(jìn)一步驗(yàn)證了LTCONS-00042843與LTCONS-00006334對其靶基因?yàn)檎{(diào)控關(guān)系。LTCONS-00042843作為miR172a的eTM,對其存在負(fù)調(diào)控作用。但對于轉(zhuǎn)入龍眼愈傷時(shí),LTCONS-00042843與LTCONS-00006334的靶基因均表現(xiàn)出相反的趨勢,與在體胚中的調(diào)控以及轉(zhuǎn)入龍眼原生質(zhì)體中的趨勢存在差異,推測是由于試驗(yàn)的材料不同導(dǎo)致其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)或調(diào)控偏好性存在差異。
【學(xué)位單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S667.2
【部分圖文】：

圖 2-1 龍眼體胚發(fā)生早期 lncRNAs 的長度分布Fig.2-1 Length distribution of lncRNAs during early longan SE圖 2-2 龍眼體胚發(fā)生早期 lncRNAs 的外顯子數(shù)目分布Fig.2-2 Exon number distribution of lncRNAs during early longan SE

22圖 2-2 龍眼體胚發(fā)生早期 lncRNAs 的外顯子數(shù)目分布Fig.2-2 Exon number distribution of lncRNAs during early longan SE對 7643 個(gè) lncRNAs 以及 47169 個(gè) mRNAs 進(jìn)行表達(dá)量分析表達(dá)的新型 lncRNAs 為 6005 個(gè)，新型 mRNAs 為 15233 個(gè) 23886 個(gè)。在 6005 個(gè)新型 lncRNAs 在 3 個(gè)樣本中的分布為ICpEC 階段 5320 個(gè)以及 GE 階段 5568 個(gè)。其中 3 個(gè)樣本共有的790 個(gè)；EC 與 ICpEC 共有的有 139 個(gè)；ICpEC 與 GE 共有的有 共有的有 165 個(gè)。對 687 個(gè)特異表達(dá) lncRNAs 分析中發(fā)現(xiàn) lncRNAs 為 159 個(gè)、ICpEC 中為 153 個(gè)、GE 中為 375 個(gè)。

圖 2-3 EC、ICpEC 和 GE 樣本間特異表達(dá) lncRNAs 的 Venn 圖iagram showing the specifically expressed lncRNAs between ECsamples發(fā)生早期 lncRNAs 分類與家族注釋05 個(gè) lncRNAs 相對于最接近編碼蛋白基因位置，將 34編碼蛋白沒有任何重疊的基因間 lncRNAs(intergenic基因座上的基因內(nèi) lncRNAs(intragenic lncRNAs)以及的反義 lncRNAs (antisense lncRNAs)[171; 172]。結(jié)果表93.37%的 lncRNAs 為基因間 lncRNAs，0.38% 的 lncR 6.25%的 lncRNAs 為反義 lncRNAs（圖 2-4）。As 家族注釋中，對比 RNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)保守區(qū)域，m
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本文編號(hào)：2876427