發(fā)布時(shí)間：2020-10-31 03:43

　　 高羊茅是耐熱性最強(qiáng)的冷季型草坪草之一,在氣候過(guò)渡地帶得到了廣泛的種植,發(fā)掘高羊茅耐熱相關(guān)基因?qū)μ岣呃浼拘筒萜翰菽蜔嵝杂兄匾囊饬x。另外,熱激轉(zhuǎn)錄因子在植物中被廣泛研究,并且普遍在耐熱性中發(fā)揮重要作用,但是對(duì)于熱激轉(zhuǎn)錄因子C類(lèi)基因的功能研究卻很少。對(duì)高羊茅C類(lèi)熱激轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行研究十分有意義。本研究從高羊茅中克隆出一個(gè)C類(lèi)Hsf:FaHsC1b,通過(guò)序列分析、亞細(xì)胞定位并在擬南芥中過(guò)表達(dá)來(lái)分析FaHsfC1b在不同非生物脅迫下的表達(dá)模式以及它對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥耐熱性的影響,研究結(jié)果如下:1以O(shè)sHsfC1b(XP_015633152)為搜索請(qǐng)求,從高羊茅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得一段1333 bp的核苷酸序列,經(jīng)FGENESH程序預(yù)測(cè),其開(kāi)放閱讀框(ORF)為744 bp,編碼247個(gè)氨基酸。通過(guò)降落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(touch down PCR)技術(shù)擴(kuò)增獲得其全長(zhǎng)編碼序列,由序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析可知該基因與其他物種中的HsfC1b有較高的相似度,故將此基因命名為高羊茅HsfC1b基因(FaHsfC1b,NCBI登錄號(hào)為KY475613)。該基因具備C類(lèi)Hsfs的基本結(jié)構(gòu),包括一個(gè)DNA結(jié)合區(qū)域、一個(gè)疏水的寡聚化結(jié)構(gòu)域、一個(gè)核定位信號(hào)結(jié)構(gòu)域。2構(gòu)建了 FaHsfC1b-eGFP重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)入到擬南芥原生質(zhì)體中觀察到綠色熒光蛋白信號(hào)與DAPI(指示細(xì)胞核)信號(hào)完全重疊;同時(shí),轉(zhuǎn)基因擬南芥根尖細(xì)胞中也觀察到相同的重疊情況,這說(shuō)明FaHsfC1b蛋白定位在細(xì)胞核中。3對(duì)高羊茅進(jìn)行非生物脅迫處理,結(jié)果顯示FaHsyC1b表達(dá)量在熱處理(45℃)、冷處理(4℃)、滲透脅迫處理(20%PEG-6000)、鹽處理(150 mMNaCl)下均在48 h內(nèi)顯著提高。在熱處理下葉片中FaHsfC1b在處理1 h即達(dá)到最高值,為對(duì)照的40倍,根部FaHsfC1b表達(dá)量在4 h開(kāi)始緩慢攀升,最后在48 h達(dá)到最大值。4構(gòu)建了 pEarleyGate103-FaHsfC1b表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入擬南芥,通過(guò)草銨膦篩選和PCR鑒定,得到20個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系。對(duì)平板中野生型(WT)和轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行高溫(45℃)處理,根據(jù)存活率篩選出4個(gè)穩(wěn)定的抗性株系,即株系5,株系6,株系16,和株系17。在FaHsfC1b過(guò)表達(dá)株系中檢測(cè)到較高的FaHsfC1b表達(dá)量,而WT中則未檢測(cè)到FaHsfC1b的表達(dá)。同時(shí),這幾個(gè)轉(zhuǎn)基因株系在冷脅迫、滲透脅迫、鹽脅迫下與WT無(wú)差異,在非脅迫條件下轉(zhuǎn)基因株系的長(zhǎng)勢(shì)也與WT無(wú)異。5在熱處理下,FaHsfC1b過(guò)表達(dá)植株比WT有更少的枯萎葉片,在恢復(fù)后葉片枯黃率更低。經(jīng)檢測(cè),過(guò)表達(dá)株系光化學(xué)效率和葉綠素含量比WT更高,電解質(zhì)滲漏率則比WT低,這說(shuō)明過(guò)量表達(dá)FaHsfC1b可以將轉(zhuǎn)基因擬南芥的代謝平衡和細(xì)胞膜穩(wěn)定性維持在較高水平,從而提高轉(zhuǎn)基因擬南芥耐熱性。6熱處理1 h后,通過(guò)DAB和NBT實(shí)驗(yàn)得知FaHsfC1b過(guò)表達(dá)植株葉片中ROS含量明顯低于WT,說(shuō)明轉(zhuǎn)基因擬南芥在熱處理下受到了較小的傷害。7 37℃ 熱處理 1h 后,AtHHsp1 8.1-CI,AtHsp22.0-ER,AtHHsp26.5-P(r)和 AtHHsp70b基因的表達(dá)量在兩個(gè)FaHsfC1b過(guò)表達(dá)株系(株系6和株系16)和WT株系中都顯著提高,但過(guò)表達(dá)植株中表達(dá)量上升幅度更大。說(shuō)明熱激蛋白在轉(zhuǎn)基因擬南芥植株耐熱性中發(fā)揮了更好的作用。綜上所述,從高羊茅中克隆到的C類(lèi)熱激轉(zhuǎn)錄因子FaHsfC1b定位于細(xì)胞核,響應(yīng)熱脅迫、冷脅迫、滲透脅迫以及鹽脅迫。通過(guò)轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥,初步確定該基因通過(guò)對(duì)生理生化及下游基因的表達(dá)調(diào)控,提高植物耐熱性。該研究為培育耐熱草坪草新種質(zhì)提供了基因資源。
【學(xué)位單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類(lèi)】：S688.4
【部分圖文】：

２．２．３?ＦａＨｓｆＣｌｂ序歹丨此對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析??采用ＭＥＧＡ?５．１進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，ＦａＨｓｆＣｌｂ與小麥、二穗短柄草、水稻、??玉米、粟（５Ｗｆｉｒｒ／ａ／／ａ／／ｃａ）中的ＨｓｆＣｌｂ都有較高的同源性（圖２－３）。故將此基因命??名為高羊茅基因。并己在ＮＣＢＩ上進(jìn)行注冊(cè)，基因登錄號(hào)為ＫＹ４７５６１３。根??據(jù)Ｂｉｏｅｄｉｔ軟件氨基酸序列比對(duì)結(jié)果（圖２－４）可知，該基因在靠近Ｎ端的部分有一個(gè)??ＤＮＡ結(jié)合區(qū)域（ＤＮＡ?ｂｉｎｄｉｎｇ?ｄｏｍａｉｎ，?ＤＢＤ），緊接著是一個(gè)疏水的寡聚化結(jié)構(gòu)域??（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ?ｄｏｍａｉｎ，?０Ｄ），也叫作ＨＲ－Ａ／Ｂ區(qū)域，靠近Ｃ端是核定位信號(hào)結(jié)構(gòu)??域（ｎｕｃｌｅａｒ?ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ?ｓｉｇｎａｌ，?ＮＬＳ）。??６２??？?ＦａＨＳＦＣＩｂ??９８?［Ｉ?ＴａＨＳＦＣＩｂ??４１Ｊ?Ｉ?ＢｄＨＳＦＣＩｂ???１?００?１?ＯｓＨＳＦＣＩｂ???ＺｍＨＳＦ３０????５ｇ１?ＳｉＨＳＦＣＩｂ???ＯｓＨＳＦＣＩａ???ＯｓＨＳＦＣ２ａ??，〇〇??ＯｓＨＳＦＣ２ｂ??圖２－３?ＦａＨｓｆＣｌｂ與其他Ｃ類(lèi)熱激轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析??Ｆｉｇ．?２－３?Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ?ｔｒｅｅ?ｏｆ?ＦａＨｓｆＣｌｂ?ａｎｄ?ｏｔｈｅｒ?ＨＳＦＣ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ??２５??

?Ｍａｒｋｅｒ??圖２－２高羊茅片段凝膠電泳圖??Ｆｉｇ．?２－２?Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＦａＨｓｆＣｌｂ?ｆｒｏｍ?ｔａｌｌ?ｆｅｓｃｕｅ??將上述克隆到的基因連接ｐＪＥＴｌ．２?ｂｌｕｎｔ?ｖｅｃｔｏｒ并用電擊法轉(zhuǎn)入大腸桿菌，將菌液??送測(cè)序公司確認(rèn)目的片段序列。該片段ＯＲＦ全長(zhǎng)７４４?ｂｐ，編碼２４７個(gè)氨基酸，與之??前預(yù)測(cè)所得完全符合。??２．２．３?ＦａＨｓｆＣｌｂ序歹丨此對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析??采用ＭＥＧＡ?５．１進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，ＦａＨｓｆＣｌｂ與小麥、二穗短柄草、水稻、??玉米、粟（５Ｗｆｉｒｒ／ａ／／ａ／／ｃａ）中的ＨｓｆＣｌｂ都有較高的同源性（圖２－３）。故將此基因命??名為高羊茅基因。并己在ＮＣＢＩ上進(jìn)行注冊(cè)，基因登錄號(hào)為ＫＹ４７５６１３。根??據(jù)Ｂｉｏｅｄｉｔ軟件氨基酸序列比對(duì)結(jié)果（圖２－４）可知，該基因在靠近Ｎ端的部分有一個(gè)??ＤＮＡ結(jié)合區(qū)域（ＤＮＡ?ｂｉｎｄｉｎｇ?ｄｏｍａｉｎ，?ＤＢＤ），緊接著是一個(gè)疏水的寡聚化結(jié)構(gòu)域??（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ?ｄｏｍａｉｎ，?０Ｄ），也叫作ＨＲ－Ａ／Ｂ區(qū)域，靠近Ｃ端是核定位信號(hào)結(jié)構(gòu)??域（ｎｕｃｌｅａｒ?ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ?ｓｉｇｎａｌ

尖部分制作玻片，于共聚焦顯微鏡下觀察，即可看到ＧＦＰ信號(hào)，再用ＤＡＰＩ染色液滴??入盛有根尖的載玻片，在顯微鏡下觀察細(xì)胞核的位置，與ＧＦＰ信號(hào)比對(duì)后兩者完全重??合（如圖２－６），再次證明了?ＦａＨｓｆＣｌｂ的核定位。??ＧＦＰ?ＤＡＰＩ?Ｂｒｉｑｈｔ?ｆｉｅｌｄ?Ｍｅｒｑｅｄ??ｍｍ：：＇、：??圖２－６乃＆尸轉(zhuǎn)基因擬南芥ＦａＨｓｆＣｌｂ蛋白在根毛上的核定位??Ｆｉｇ．?２－６?Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＦａＨｓｆＣｌｂ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｉｎ?ｒｏｏｔ?ｈａｉｒ?ｏｆ?ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ?ｐｌａｎｔｓ．??在高倍放大鏡下觀察到的擬南芥根毛ＧＦＰ信號(hào)、細(xì)胞核與ＧＦＰ信號(hào)重疊情況。Ｂａｒ＝１０Ｍｍ。??Ｔｈｒｅｅ－ｄａｙ－ｏｌｄ?ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ?ｉｎ?ｃｕｌｔｕｒｅ?ｄｉｓｈ?ｗｅｒｅ?ｏｂｓｅｒｖｅｄ?ｕｎｄｅｒ?ｈｉｇｈｅｒ?ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．??Ｂａｒ＝１０?（ｉｍ．??２．２．５?在非生物肋、迫下的表達(dá)分析??將水培培養(yǎng)２周左右的高羊茅植株在４５°Ｃ、４°Ｃ、２０?％?ＰＥＧ－６０００及１５０?ｍＭ?ＮａＣｌ??條件分別處理４８ｈ，在Ｏｈ、ｌｈ、２ｈ、４ｈ、１２ｈ、２４ｈ、４８ｈ取樣，提取總ＲＮＡ后，??反轉(zhuǎn)錄成單鏈ｃＤＮＡ。通過(guò)ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)在各種非生物脅迫下的表達(dá)情況，??以作為內(nèi)參基因。ｑＲＴ－ＰＣＲ結(jié)果如圖２－７所示，表達(dá)量在缺水處??理、鹽處理、熱處理、冷處理下均在４８?ｈ內(nèi)顯著提高，從的表達(dá)模式因不同??處理、不同組織部位而不同。??在熱處理和冷處理下，高羊茅葉片中Ａ／＊／Ｃ乃比根部更早表現(xiàn)出表達(dá)??量的激增
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