大多數(shù)柑橘通過(guò)無(wú)性繁殖產(chǎn)生后代,主要體現(xiàn)在兩個(gè)途徑:一是種子通過(guò)無(wú)融合生殖途徑;二是農(nóng)藝措施上通過(guò)嫁接的繁殖方法。無(wú)融合生殖產(chǎn)生的柑橘多胚現(xiàn)象使大多數(shù)柑橘雜交后很難得到雜種,影響了育種效率;但同時(shí)無(wú)融合生殖導(dǎo)致性狀不分離,為固定雜種優(yōu)勢(shì)提供了重要的途徑。嫁接作為傳統(tǒng)的無(wú)性繁殖方法,通過(guò)接穗—砧木復(fù)合體的形式改良作物的抗性、品質(zhì)和產(chǎn)量等,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于柑橘等多年生果樹(shù)的良種繁育。嫁接嵌合體是嫁接過(guò)程中產(chǎn)生的一類(lèi)特殊材料,為研究植物組織細(xì)胞層發(fā)育及細(xì)胞層間相互作用提供了寶貴材料。本研究針對(duì)柑橘無(wú)性繁殖的特性,通過(guò)分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)驗(yàn)證及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比較,揭示了多胚性狀的遺傳規(guī)律及珠心胚產(chǎn)生的分子基礎(chǔ);分析了柑橘砧木—枳(甜橙為對(duì)照)作砧木對(duì)接穗生長(zhǎng)發(fā)育、代謝物積累及DNA甲基化水平的影響,并解析了枳和甜橙的地上與地下組織DNA甲基化圖譜;利用兩組柑橘嫁接嵌合體構(gòu)建了柑橘不同組織器官的細(xì)胞層起源模型,并初步篩選了響應(yīng)細(xì)胞層間互作的基因及細(xì)胞層特異表達(dá)的基因。主要研究結(jié)果如下:1、多胚候選基因分析及關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)驗(yàn)證通過(guò)對(duì)前期定位的80Kb多胚候選區(qū)段進(jìn)行克隆分析,確定該區(qū)段共有11個(gè)候選基因。利用11個(gè)候選基因序列SNP與多胚性狀進(jìn)行局部關(guān)聯(lián)分析,鎖定了兩個(gè)與多胚性狀高度關(guān)聯(lián)的候選基因(Cg4g018970和Cg4g018910)。在基因Cg4g018910中,發(fā)現(xiàn)有10個(gè)SNP和一個(gè)6bp的缺失與多胚性狀高度關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步將6bp的缺失開(kāi)發(fā)成共顯性InDel標(biāo)記,利用該標(biāo)記在786份柑橘資源中驗(yàn)證分析發(fā)現(xiàn),所有213份多胚材料中均存在6bp的缺失,而所有573份單胚材料均不存在6bp的缺失。同時(shí),利用該標(biāo)記對(duì)“HB柚(單胚)×Fairchild橘(多胚)”雜交F_1代群體進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)124株已有表型的后代中58個(gè)多胚單株均存在6bp的缺失,66個(gè)單胚單株均不含有6bp的缺失。以上結(jié)果表明,6bp的缺失與柑橘多胚性狀高度連鎖,該InDel標(biāo)記可以有效鑒別柑橘單胚和多胚基因型。2、單胚和多胚柑橘品種轉(zhuǎn)錄組比較對(duì)單胚的晚白柚和多胚的甜橙葉片、胚珠、果實(shí)和種子四個(gè)不同組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較,分別從晚白柚和甜橙中篩選到1637和1840個(gè)在胚珠中特異高表達(dá)的基因,其中有853個(gè)基因在晚白柚和甜橙胚珠中同時(shí)特異高表達(dá)。GO富集分析發(fā)現(xiàn),只在甜橙胚珠中特異高表達(dá)的987個(gè)基因與853個(gè)在單胚和多胚品種中同時(shí)高表達(dá)的基因富集的生物過(guò)程相似,暗示珠心胚與合子胚經(jīng)歷著相似的發(fā)育起始過(guò)程。為了探究珠心胚與合子胚起始發(fā)育的分子基礎(chǔ),選取了3對(duì)單胚與多胚柑橘品種(柚—葡萄柚、枸櫞—檸檬、克里曼丁橘—椪柑)對(duì)珠心胚起始發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期的胚珠進(jìn)行了比較轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果篩選到29個(gè)同時(shí)在三對(duì)材料中呈現(xiàn)顯著差異表達(dá)的基因,基因功能注釋分析發(fā)現(xiàn)其中部分基因與逆境響應(yīng)及氧化還原反應(yīng)等生物過(guò)程相關(guān)。此外,調(diào)控柑橘多胚性狀的關(guān)鍵基因CitRWP在多胚品種胚珠中的表達(dá)量顯著高于單胚品種。3、枳砧嫁接對(duì)接穗的影響通過(guò)設(shè)置枳砧和本砧嫁接甜橙兩個(gè)組合進(jìn)行嫁接對(duì)比實(shí)驗(yàn),分析枳砧嫁接對(duì)接穗生理指標(biāo)、代謝及甲基化水平的影響。接穗生長(zhǎng)指標(biāo)及礦物質(zhì)元素測(cè)定結(jié)果表明,枳作砧木對(duì)接穗有矮化作用,枳砧嫁接能夠提高甜橙中鉀(K)和硼(B)元素的含量,同時(shí)降低了鈣(Ca)、鎂(Mg)、鍶(Sr)和鉛(Rb)等元素的含量。對(duì)接穗葉片進(jìn)行廣泛靶向代謝組分析,共檢測(cè)到682種代謝物,其中有47種代謝物在枳砧嫁接的接穗葉片中含量顯著升高,21種代謝物含量顯著降低。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)差異代謝物主要富集在類(lèi)黃酮代謝通路,類(lèi)黃酮代謝通路上游的基因也上調(diào)表達(dá),表明枳砧嫁接能夠促進(jìn)接穗類(lèi)黃酮積累。此外,對(duì)接穗中DNA甲基化相關(guān)基因表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)與去甲基化相關(guān)的3個(gè)DME(DNA Glycosylases DEMETER)基因上調(diào)表達(dá),重亞硫酸鹽測(cè)序結(jié)果表明枳作砧木導(dǎo)致接穗中DNA甲基化水平降低3%左右。4、枳和甜橙的地上與地下組織甲基化圖譜為了比較常用砧木與栽培品種的DNA甲基化模式差異,對(duì)枳和甜橙地上組織(shoot)和地下組織(root)進(jìn)行重亞硫酸鹽測(cè)序分析。結(jié)果表明,枳的地上組織、枳的地下組織、甜橙的地上組織和甜橙的地下組織四個(gè)組織中,CG型甲基化水平處于42.75%至49.14%之間;CHG型甲基化水平處于23.78%至28.89%之間;CHH型甲基化水平為7%左右。枳和甜橙相比,枳中CG和CHG型的DNA甲基化水平比甜橙低。地上和地下組織相比,枳地下組織CG和CHG型甲基化水平高于地上組織,而甜橙中則相反;CHH型甲基化水平地下組織均低于地上組織。DNA甲基化位點(diǎn)在染色體上呈不均勻分布狀態(tài)。DNA甲基化與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)聯(lián)合分析,發(fā)現(xiàn)DNA甲基化能部分影響基因表達(dá)水平。5、嫁接嵌合體遺傳機(jī)制及柑橘不同組織器官細(xì)胞層起源基于基因組信息,開(kāi)發(fā)了一系列InDel和SNP標(biāo)記從分子層面驗(yàn)證了‘早紅’和‘紅肉桃葉橙’兩組嵌合體的細(xì)胞層起源。利用兩組嵌合體材料,追蹤柑橘不同組織器官的細(xì)胞層起源,發(fā)現(xiàn)柑橘的葉片和花器官各組織均由三層細(xì)胞共同發(fā)育而來(lái);果實(shí)外果皮、囊衣和汁胞由三層細(xì)胞共同發(fā)育而來(lái),而中果皮和大維管束起源于L2/L3層細(xì)胞;在種子中,內(nèi)種皮源自三層細(xì)胞共同發(fā)育,而外種皮、子葉、胚以及胚萌發(fā)的幼苗由L2/L3層細(xì)胞發(fā)育而來(lái)。同時(shí)發(fā)現(xiàn),在不同組織器官中,各細(xì)胞層的貢獻(xiàn)比例不同。利用‘早紅’嵌合體及兩親本轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),在‘早紅’嵌合體外果皮或汁胞中篩選到215個(gè)由于細(xì)胞層間互作激活表達(dá)的基因,155個(gè)被細(xì)胞層間互作抑制表達(dá)的基因;利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)合兩親本之間基因編碼區(qū)SNP信息鑒定了59個(gè)L1層特異表達(dá)的基因和1116個(gè)L2/L3層特異表達(dá)的基因。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：S666
【部分圖文】：

圖 1-1 單胚（左）與多胚（右）柑橘的種子（A）和幼苗（B）形態(tài)。Fig. 1-1 Phenotype of seeds (A) and seedlings (B) from monoembryonic (left) and polyembryonic(right) citrus.1.2.1.2 嫁接繁殖嫁接，是通過(guò)人工營(yíng)養(yǎng)繁殖的一種方式，即把一個(gè)植株的枝或芽切下，緊密貼合到另一個(gè)植株的莖或根上，使結(jié)合在一起的兩個(gè)部分長(zhǎng)成一個(gè)完整的植株（Melnykand Meyerowitz 2015）。嫁接過(guò)程中被接上去的枝或芽稱(chēng)為接穗，承受接穗的部分稱(chēng)為砧木。嫁接主要是利用植物較強(qiáng)的再生能力，切割產(chǎn)生的傷口能夠產(chǎn)生愈傷組織使兩部分組織有機(jī)的結(jié)合（Melnyk 2016）。嫁接有著非常久遠(yuǎn)的歷史，在公元前1560 年的中國(guó)、公元前 500 年的地中海地區(qū)以及羅馬地區(qū)，都有關(guān)于使用嫁接技術(shù)的證據(jù)記載（Lee and Oda 2003；Mudge et al 2009）。在果樹(shù)、蔬菜和花卉等其他經(jīng)濟(jì)作物生產(chǎn)中，嫁接繁殖應(yīng)用非常廣泛，并產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。通過(guò)嫁接，可

柑橘無(wú)融合生殖和嫁接嵌合的分子基礎(chǔ)研究嫁接繁殖在柑橘中應(yīng)用非常廣泛，幾乎所有的栽培品種都是嫁接在砧木上進(jìn)行生產(chǎn)。柑橘嫁接繁殖一般包括：砧木和接穗的選擇、削芽、砧穗對(duì)接、綁縛、剪砧和解綁等過(guò)程（圖 1-2）。嫁接繁殖可以快速實(shí)現(xiàn)優(yōu)良柑橘品系的規(guī)�；a(chǎn)，同時(shí)由于砧木和接穗分別來(lái)自?xún)蓚�(gè)不同個(gè)體，兩者之間存在著顯著的相互作用，砧木對(duì)接穗品種的長(zhǎng)勢(shì)、童期、產(chǎn)量、品質(zhì)和栽培適應(yīng)性等具有重要影響。

圖 1-3 三類(lèi)嵌合體莖尖橫切示意圖（Marcotrigiano 1997）。（A）扇形嵌合體；（B）周緣嵌合體；（C）混合嵌合體。白色和灰色分別代表兩種不同遺傳來(lái)源的細(xì)胞。Fig. 1-3 Schematic diagram of shoot apical meristem crosscutting in three types of chimeras(Marcotrigiano 1997). (A) Sectorial chimera; (B) Periclinal chimera; (C) Mericlinal chimera. Whiteand grey colors represent two kinds of cells with different genetic origin.1.2.4.2 植物嵌合體的形成方式植物嵌合體的形成主要通過(guò)兩種途徑：一種是植物頂端分生組織特定部位細(xì)胞發(fā)生突變形成嵌合體；另外一種是兩個(gè)植物個(gè)體的細(xì)胞鑲嵌發(fā)育成嵌合體。在植物頂端分生組織發(fā)育過(guò)程中，由于受到外界或者內(nèi)部刺激，分生組織特定部位的細(xì)胞發(fā)生變異，而其周?chē)募?xì)胞仍然保持正常狀態(tài)，發(fā)生變異的細(xì)胞和沒(méi)有發(fā)生變異的細(xì)胞同時(shí)分裂、分化，共同發(fā)育成一個(gè)植物個(gè)體或器官（圖 1-4）。植物頂端分生組織發(fā)生突變形成嵌合體的現(xiàn)象非常普遍，如葡萄果皮色澤嵌合體
【參考文獻(xiàn)】

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1 吳巨勛;肖慧玲;王小花;伊華林;;嫁接嵌合體‘早紅’臍橙果實(shí)細(xì)胞來(lái)源鑒定及其糖酸和香氣物質(zhì)分析[J];園藝學(xué)報(bào);2014年10期

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3 王海寧;葛順?lè)?姜遠(yuǎn)茂;魏紹沖;陳倩;孫聰偉;;不同砧木嫁接的富士蘋(píng)果幼樹(shù)~(13)C和~(15)N分配利用特性比較[J];園藝學(xué)報(bào);2013年04期

4 王燕;李俊星;陳利萍;;利用蕓薹屬植物嵌合體對(duì)組織與器官細(xì)胞層起源的研究[J];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2011年08期

5 吳洪明,林寶明,賴(lài)鐘雄,呂柳新,林桂芳,潘東明,楊江帆;一個(gè)蕓香科屬間嫁接嵌合體的拉丁名稱(chēng):+Citroponcirus‘Hormish’[J];熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào);2004年02期

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本文編號(hào)：2860531