大多數(shù)柑橘通過無性繁殖產(chǎn)生后代,主要體現(xiàn)在兩個途徑:一是種子通過無融合生殖途徑;二是農(nóng)藝措施上通過嫁接的繁殖方法。無融合生殖產(chǎn)生的柑橘多胚現(xiàn)象使大多數(shù)柑橘雜交后很難得到雜種,影響了育種效率;但同時無融合生殖導(dǎo)致性狀不分離,為固定雜種優(yōu)勢提供了重要的途徑。嫁接作為傳統(tǒng)的無性繁殖方法,通過接穗—砧木復(fù)合體的形式改良作物的抗性、品質(zhì)和產(chǎn)量等,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于柑橘等多年生果樹的良種繁育。嫁接嵌合體是嫁接過程中產(chǎn)生的一類特殊材料,為研究植物組織細胞層發(fā)育及細胞層間相互作用提供了寶貴材料。本研究針對柑橘無性繁殖的特性,通過分子標(biāo)記開發(fā)驗證及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比較,揭示了多胚性狀的遺傳規(guī)律及珠心胚產(chǎn)生的分子基礎(chǔ);分析了柑橘砧木—枳(甜橙為對照)作砧木對接穗生長發(fā)育、代謝物積累及DNA甲基化水平的影響,并解析了枳和甜橙的地上與地下組織DNA甲基化圖譜;利用兩組柑橘嫁接嵌合體構(gòu)建了柑橘不同組織器官的細胞層起源模型,并初步篩選了響應(yīng)細胞層間互作的基因及細胞層特異表達的基因。主要研究結(jié)果如下:1、多胚候選基因分析及關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記開發(fā)驗證通過對前期定位的80Kb多胚候選區(qū)段進行克隆分析,確定該區(qū)段共有11個候選基因。利用11個候選基因序列SNP與多胚性狀進行局部關(guān)聯(lián)分析,鎖定了兩個與多胚性狀高度關(guān)聯(lián)的候選基因(Cg4g018970和Cg4g018910)。在基因Cg4g018910中,發(fā)現(xiàn)有10個SNP和一個6bp的缺失與多胚性狀高度關(guān)聯(lián)。進一步將6bp的缺失開發(fā)成共顯性InDel標(biāo)記,利用該標(biāo)記在786份柑橘資源中驗證分析發(fā)現(xiàn),所有213份多胚材料中均存在6bp的缺失,而所有573份單胚材料均不存在6bp的缺失。同時,利用該標(biāo)記對“HB柚(單胚)×Fairchild橘(多胚)”雜交F_1代群體進行分析,發(fā)現(xiàn)124株已有表型的后代中58個多胚單株均存在6bp的缺失,66個單胚單株均不含有6bp的缺失。以上結(jié)果表明,6bp的缺失與柑橘多胚性狀高度連鎖,該InDel標(biāo)記可以有效鑒別柑橘單胚和多胚基因型。2、單胚和多胚柑橘品種轉(zhuǎn)錄組比較對單胚的晚白柚和多胚的甜橙葉片、胚珠、果實和種子四個不同組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行比較,分別從晚白柚和甜橙中篩選到1637和1840個在胚珠中特異高表達的基因,其中有853個基因在晚白柚和甜橙胚珠中同時特異高表達。GO富集分析發(fā)現(xiàn),只在甜橙胚珠中特異高表達的987個基因與853個在單胚和多胚品種中同時高表達的基因富集的生物過程相似,暗示珠心胚與合子胚經(jīng)歷著相似的發(fā)育起始過程。為了探究珠心胚與合子胚起始發(fā)育的分子基礎(chǔ),選取了3對單胚與多胚柑橘品種(柚—葡萄柚、枸櫞—檸檬、克里曼丁橘—椪柑)對珠心胚起始發(fā)育關(guān)鍵時期的胚珠進行了比較轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果篩選到29個同時在三對材料中呈現(xiàn)顯著差異表達的基因,基因功能注釋分析發(fā)現(xiàn)其中部分基因與逆境響應(yīng)及氧化還原反應(yīng)等生物過程相關(guān)。此外,調(diào)控柑橘多胚性狀的關(guān)鍵基因CitRWP在多胚品種胚珠中的表達量顯著高于單胚品種。3、枳砧嫁接對接穗的影響通過設(shè)置枳砧和本砧嫁接甜橙兩個組合進行嫁接對比實驗,分析枳砧嫁接對接穗生理指標(biāo)、代謝及甲基化水平的影響。接穗生長指標(biāo)及礦物質(zhì)元素測定結(jié)果表明,枳作砧木對接穗有矮化作用,枳砧嫁接能夠提高甜橙中鉀(K)和硼(B)元素的含量,同時降低了鈣(Ca)、鎂(Mg)、鍶(Sr)和鉛(Rb)等元素的含量。對接穗葉片進行廣泛靶向代謝組分析,共檢測到682種代謝物,其中有47種代謝物在枳砧嫁接的接穗葉片中含量顯著升高,21種代謝物含量顯著降低。進一步分析發(fā)現(xiàn)差異代謝物主要富集在類黃酮代謝通路,類黃酮代謝通路上游的基因也上調(diào)表達,表明枳砧嫁接能夠促進接穗類黃酮積累。此外,對接穗中DNA甲基化相關(guān)基因表達分析,發(fā)現(xiàn)與去甲基化相關(guān)的3個DME(DNA Glycosylases DEMETER)基因上調(diào)表達,重亞硫酸鹽測序結(jié)果表明枳作砧木導(dǎo)致接穗中DNA甲基化水平降低3%左右。4、枳和甜橙的地上與地下組織甲基化圖譜為了比較常用砧木與栽培品種的DNA甲基化模式差異,對枳和甜橙地上組織(shoot)和地下組織(root)進行重亞硫酸鹽測序分析。結(jié)果表明,枳的地上組織、枳的地下組織、甜橙的地上組織和甜橙的地下組織四個組織中,CG型甲基化水平處于42.75%至49.14%之間;CHG型甲基化水平處于23.78%至28.89%之間;CHH型甲基化水平為7%左右。枳和甜橙相比,枳中CG和CHG型的DNA甲基化水平比甜橙低。地上和地下組織相比,枳地下組織CG和CHG型甲基化水平高于地上組織,而甜橙中則相反;CHH型甲基化水平地下組織均低于地上組織。DNA甲基化位點在染色體上呈不均勻分布狀態(tài)。DNA甲基化與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)聯(lián)合分析,發(fā)現(xiàn)DNA甲基化能部分影響基因表達水平。5、嫁接嵌合體遺傳機制及柑橘不同組織器官細胞層起源基于基因組信息,開發(fā)了一系列InDel和SNP標(biāo)記從分子層面驗證了‘早紅’和‘紅肉桃葉橙’兩組嵌合體的細胞層起源。利用兩組嵌合體材料,追蹤柑橘不同組織器官的細胞層起源,發(fā)現(xiàn)柑橘的葉片和花器官各組織均由三層細胞共同發(fā)育而來;果實外果皮、囊衣和汁胞由三層細胞共同發(fā)育而來,而中果皮和大維管束起源于L2/L3層細胞;在種子中,內(nèi)種皮源自三層細胞共同發(fā)育,而外種皮、子葉、胚以及胚萌發(fā)的幼苗由L2/L3層細胞發(fā)育而來。同時發(fā)現(xiàn),在不同組織器官中,各細胞層的貢獻比例不同。利用‘早紅’嵌合體及兩親本轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),在‘早紅’嵌合體外果皮或汁胞中篩選到215個由于細胞層間互作激活表達的基因,155個被細胞層間互作抑制表達的基因;利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)合兩親本之間基因編碼區(qū)SNP信息鑒定了59個L1層特異表達的基因和1116個L2/L3層特異表達的基因。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S666
【部分圖文】：

圖 1-1 單胚（左）與多胚（右）柑橘的種子（A）和幼苗（B）形態(tài)。Fig. 1-1 Phenotype of seeds (A) and seedlings (B) from monoembryonic (left) and polyembryonic(right) citrus.1.2.1.2 嫁接繁殖嫁接，是通過人工營養(yǎng)繁殖的一種方式，即把一個植株的枝或芽切下，緊密貼合到另一個植株的莖或根上，使結(jié)合在一起的兩個部分長成一個完整的植株（Melnykand Meyerowitz 2015）。嫁接過程中被接上去的枝或芽稱為接穗，承受接穗的部分稱為砧木。嫁接主要是利用植物較強的再生能力，切割產(chǎn)生的傷口能夠產(chǎn)生愈傷組織使兩部分組織有機的結(jié)合（Melnyk 2016）。嫁接有著非常久遠的歷史，在公元前1560 年的中國、公元前 500 年的地中海地區(qū)以及羅馬地區(qū)，都有關(guān)于使用嫁接技術(shù)的證據(jù)記載（Lee and Oda 2003；Mudge et al 2009）。在果樹、蔬菜和花卉等其他經(jīng)濟作物生產(chǎn)中，嫁接繁殖應(yīng)用非常廣泛，并產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟價值。通過嫁接，可

柑橘無融合生殖和嫁接嵌合的分子基礎(chǔ)研究嫁接繁殖在柑橘中應(yīng)用非常廣泛，幾乎所有的栽培品種都是嫁接在砧木上進行生產(chǎn)。柑橘嫁接繁殖一般包括：砧木和接穗的選擇、削芽、砧穗對接、綁縛、剪砧和解綁等過程（圖 1-2）。嫁接繁殖可以快速實現(xiàn)優(yōu)良柑橘品系的規(guī)�；a(chǎn)，同時由于砧木和接穗分別來自兩個不同個體，兩者之間存在著顯著的相互作用，砧木對接穗品種的長勢、童期、產(chǎn)量、品質(zhì)和栽培適應(yīng)性等具有重要影響。

圖 1-3 三類嵌合體莖尖橫切示意圖（Marcotrigiano 1997）。（A）扇形嵌合體；（B）周緣嵌合體；（C）混合嵌合體。白色和灰色分別代表兩種不同遺傳來源的細胞。Fig. 1-3 Schematic diagram of shoot apical meristem crosscutting in three types of chimeras(Marcotrigiano 1997). (A) Sectorial chimera; (B) Periclinal chimera; (C) Mericlinal chimera. Whiteand grey colors represent two kinds of cells with different genetic origin.1.2.4.2 植物嵌合體的形成方式植物嵌合體的形成主要通過兩種途徑：一種是植物頂端分生組織特定部位細胞發(fā)生突變形成嵌合體；另外一種是兩個植物個體的細胞鑲嵌發(fā)育成嵌合體。在植物頂端分生組織發(fā)育過程中，由于受到外界或者內(nèi)部刺激，分生組織特定部位的細胞發(fā)生變異，而其周圍的細胞仍然保持正常狀態(tài)，發(fā)生變異的細胞和沒有發(fā)生變異的細胞同時分裂、分化，共同發(fā)育成一個植物個體或器官（圖 1-4）。植物頂端分生組織發(fā)生突變形成嵌合體的現(xiàn)象非常普遍，如葡萄果皮色澤嵌合體
【參考文獻】

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1 吳巨勛;肖慧玲;王小花;伊華林;;嫁接嵌合體‘早紅’臍橙果實細胞來源鑒定及其糖酸和香氣物質(zhì)分析[J];園藝學(xué)報;2014年10期

2 張斯淇;徐強;鄧秀新;;無融合生殖與柑橘多胚現(xiàn)象的研究進展[J];植物科學(xué)學(xué)報;2014年01期

3 王海寧;葛順峰;姜遠茂;魏紹沖;陳倩;孫聰偉;;不同砧木嫁接的富士蘋果幼樹~(13)C和~(15)N分配利用特性比較[J];園藝學(xué)報;2013年04期

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1 余惠文;柚遺傳多樣性及葉片漸綠性狀突變研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

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4 張敏;柑橘果實扇形嵌合體的分離及兩組嫁接嵌合體的遺傳研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

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本文編號：2860531