草莓(Fragaria × ananassa Duch.)屬于薔薇科草莓屬多年生草本植物,是重要的經(jīng)濟(jì)植物。低溫脅迫影響草莓生長(zhǎng)發(fā)育,是草莓越冬生產(chǎn)的主要限制因素,利用基因工程技術(shù)培育耐寒草莓品種是快速有效的育種途徑。DREB/CBF轉(zhuǎn)錄因子是重要的逆境應(yīng)答調(diào)控因子,其中DREB1B在植物耐寒性方面具有重要的作用。本研究以水稻RdreB1BI轉(zhuǎn)基因'紅頰'草莓單拷貝耐寒株系為試驗(yàn)材料,借助數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)(digitalgeneexpression,DGE)獲得了低溫脅迫下RdreB1BI轉(zhuǎn)基因草莓的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),分析差異表達(dá)的基因,并利用雙向凝膠電泳技術(shù)(2-DE)和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF/TOF)探究低溫脅迫后RdreB1BI轉(zhuǎn)基因草莓中差異積累的蛋白質(zhì)。進(jìn)而從蛋白組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)掘花青苷和AQP等相關(guān)作用因子,從組學(xué)、形態(tài)及生理水平上系統(tǒng)研究了RdreB1BI提高'紅頰'草莓耐寒性及耐旱性的分子機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:1.為了研究RdreB1BI在基因調(diào)控方面介導(dǎo)草莓耐寒性的作用機(jī)理,利用Illumina/Solexa高通量測(cè)序技術(shù),獲得了RdreB1B 轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因草莓在低溫脅迫下的數(shù)字基因表達(dá)譜信息,每個(gè)樣品獲得超過350萬個(gè)干凈標(biāo)簽。轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因植株有1119個(gè)差異表達(dá)基因。低溫誘導(dǎo)后非轉(zhuǎn)基因植株中有1202個(gè)差異表達(dá)基因,轉(zhuǎn)基因植株中有1517個(gè)差異表達(dá)基因,其中有443個(gè)共有差異表達(dá)基因。共有差異基因中編碼PP2C、PIF、GDSL脂肪酶等逆境響應(yīng)蛋白的功能基因在轉(zhuǎn)基因植株中的差異表達(dá)倍數(shù)顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株。此外部分調(diào)控基因在轉(zhuǎn)基因植株中特異表達(dá),RdreB1B1可通過DRE/CRT順式作用元件與逆境相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子諸如ZFP、bZIP、NAC等相互作用共同調(diào)控轉(zhuǎn)基因植物的耐寒性。2.為了進(jìn)一步研究RdreB1BI在蛋白調(diào)控方面介導(dǎo)草莓耐寒性的作用機(jī)理,利用雙向凝膠電泳技術(shù)和質(zhì)譜測(cè)序技術(shù)分析低溫脅迫下非轉(zhuǎn)基因和RdreB1BI轉(zhuǎn)基因草莓的差異蛋白質(zhì)積累圖譜。檢測(cè)到超過300個(gè)重演性較高的蛋白質(zhì)點(diǎn)(p0.05),與非轉(zhuǎn)基因草莓的蛋白質(zhì)圖譜比較,有21個(gè)蛋白點(diǎn)的豐度差異在2倍以上,經(jīng)測(cè)序及蛋白質(zhì)序列比對(duì)分析表明這些差異蛋白質(zhì)包括光合作用蛋白(RCA1)、抗氧化物蛋白(Cu/Zn-SOD)、胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(Lea14-A)、真核細(xì)胞翻譯啟動(dòng)因子(eIF5A)等。其中RCA1、Cu/Zn-SOD和eIF5A與轉(zhuǎn)錄組中相應(yīng)差異基因的關(guān)聯(lián)性較強(qiáng),這些脅迫相關(guān)蛋白的積累有助于提高草莓耐寒性,相關(guān)差異積累蛋白的鑒定為DREB1B靶蛋白的研究提供了新的目標(biāo)。3.結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及植株生理表型,研究表明花青苷合成途徑中關(guān)鍵酶編碼基因在RdreB1BI轉(zhuǎn)基因草莓中差異表達(dá),并且轉(zhuǎn)基因植株存在明顯的花青苷積累。這些基因包括PAL、C4H、4CL、CHI、F3H、DFR等,大部分基因在轉(zhuǎn)基因植株中上調(diào)表達(dá),它們參與了從苯丙氨酸到花青苷的合成代謝途徑。另外,這些基因的啟動(dòng)子區(qū)域含有能被DREB1B特異識(shí)別的DRE/CRT順式作用元件(G/ACCGAC)。RdreB1BI轉(zhuǎn)基因草莓植株葉柄基部及匍匐莖上有明顯的花色素積累�；ㄇ嘬障嚓P(guān)功能基因及轉(zhuǎn)錄因子基因在轉(zhuǎn)基因草莓葉片、匍匐莖及果實(shí)中都有明顯地上調(diào)表達(dá)。結(jié)果表明RdreB1BI增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株中花青苷相關(guān)基因的表達(dá),促進(jìn)了花青苷含量的積累,有助于轉(zhuǎn)基因植株耐寒性的提高。4.蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示RdreB1BI轉(zhuǎn)基因草莓中與干旱相關(guān)的蛋白質(zhì)積累豐度和基因表達(dá)量與非轉(zhuǎn)基因植株相比具有顯著差異,因此我們進(jìn)一步研究了轉(zhuǎn)RdreB1BI基因草莓對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)。研究結(jié)果表明RdreB1BI能特異結(jié)合差異表達(dá)基因FvPIP2;1的啟動(dòng)子區(qū)域,并促進(jìn)PIP相關(guān)水通道蛋白基因的表達(dá)。生理層面上,轉(zhuǎn)基因草莓在干旱脅迫下質(zhì)膜相對(duì)電導(dǎo)率顯著低于非轉(zhuǎn)基因植株,且轉(zhuǎn)基因草莓具有較高的相對(duì)含水量,干旱處理后轉(zhuǎn)基因草莓氣孔開度顯著小于非轉(zhuǎn)基因植株,此外抗氧化酶POD、SOD酶活性較高,過氧化物質(zhì)MDA含量較低,轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出較高的耐旱性。通過熒光定量PCR表達(dá)分析,轉(zhuǎn)基因植株中NAC、RD22、ABI、NCED等基因的表達(dá)量明顯高于非轉(zhuǎn)基因植株。從形態(tài)、生理和轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果表明RdreBIBI轉(zhuǎn)基因草莓同時(shí)具有較高的耐旱性。
【學(xué)位單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S668.4
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 植物耐寒性研究進(jìn)展
        1.1 低溫脅迫對(duì)植物細(xì)胞膜的影響
        1.2 低溫脅迫對(duì)植物光合作用的影響
        1.3 低溫脅迫對(duì)植物呼吸作用的影響
        1.4 低溫脅迫對(duì)植物保護(hù)酶活性的影響
        1.5 植物響應(yīng)低溫脅迫的功能蛋白
    2 DREB1s/CBFS轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展
        2.1 DRE/CRT順式作用元件
        2.2 DREB1s/CBFs家族
        2.3 DREB1s/CBFs的表達(dá)調(diào)控
        2.4 DREB1s/CBFs在植物耐寒性中的作用
    3 植物蛋白組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究
        3.1 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究策略
        3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)在環(huán)境脅迫中的應(yīng)用
        3.3 蛋白質(zhì)組學(xué)在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用
        3.4 植物轉(zhuǎn)錄組學(xué)與數(shù)字表達(dá)譜技術(shù)
        3.5 數(shù)字基因表達(dá)譜的應(yīng)用
    4 草莓基因工程育種研究
        4.1 草莓轉(zhuǎn)基因育種概況
        4.2 草莓耐寒轉(zhuǎn)基因育種
    5 研究目的與意義
第二章 低溫脅迫下RdreB1BI轉(zhuǎn)基因'紅頰'草莓轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究
    1 材料與方法
        1.1 植物材料與處理
        1.2 試劑與設(shè)備
        1.3 構(gòu)建cDNA文庫以及高通量測(cè)序
        1.4 數(shù)字基因表達(dá)譜的生物信息學(xué)分析
        1.5 Gene Ontology功能與Pathway顯著性富集分析
        1.6 差異表達(dá)基因熒光定量PCR驗(yàn)證
    2 結(jié)果與分析
        2.1 Tag分析
        2.2 差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)
        2.3 差異表達(dá)基因的GO分類
        2.4 差異表達(dá)基因的通路富集分析
        2.5 轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因草莓中同時(shí)差異表達(dá)基因比較
        2.6 編碼轉(zhuǎn)錄因子的差異表達(dá)基因
        2.7 熒光定量PCR驗(yàn)證
    3 討論
        3.1 轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因草莓的轉(zhuǎn)錄組差異
        3.2 非生物逆境脅迫相關(guān)基因
        3.3 轉(zhuǎn)錄因子間的相互作用
第三章 低溫脅迫下RdreB1BI轉(zhuǎn)基因'紅頰'草莓蛋白質(zhì)組學(xué)研究
    1 材料與方法
        1.1 植物材料與處理
        1.2 總蛋白質(zhì)的提取與定量
        1.3 雙向凝膠電泳
        1.4 凝膠圖像分析和質(zhì)譜鑒定
        1.5 蛋白質(zhì)信息搜索
    2 結(jié)果與分析
        2.1 RdreB1BI轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因草莓葉片2-DE蛋白圖譜分析
        2.2 差異蛋白質(zhì)分類
    3 討論
        3.1 低溫脅迫下光合作用相關(guān)的差異蛋白質(zhì)
        3.2 細(xì)胞質(zhì)中銅/鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）
        3.3 胚胎發(fā)育后期富集蛋白（LEA）
        3.4 真核生物翻譯起始因子（eIF5A）
        3.5 冷響應(yīng)相關(guān)的表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTs）
第四章 外源RdreB1BI基因?qū)?紅頰'草莓花青苷積累的影響
    1 材料與方法
        1.1 植物材料
        1.2 試劑與設(shè)備
        1.3 花青苷含量測(cè)定
        1.4 熒光定量PCR分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的花青苷合成途徑
        2.2 草莓植株及果實(shí)中花青苷含量的測(cè)定
        2.3 花青苷合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析
    3 討論
第五章 外源RdreB1BI基因?qū)?紅頰'草莓耐旱性影響
    1 材料與方法
        1.1 植物材料與干旱處理
        1.2 酵母單雜交
        1.3 生理指標(biāo)測(cè)定
        1.4 RNA提取及熒光定量PCR
        1.5 統(tǒng)計(jì)分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 轉(zhuǎn)錄組中篩選出的差異表達(dá)基因
        2.2 差異表達(dá)基因的啟動(dòng)子序列分析
        2.3 酵母單雜交分析
        2.4 FvPIP2;1啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析
        2.5 干旱脅迫下植株和氣孔的觀察與比較
        2.6 干旱脅迫下細(xì)胞膜穩(wěn)定性和葉片水分狀態(tài)
        2.7 干旱脅迫下抗氧化酶活性和脂質(zhì)過氧化物含量
        2.8 AQP及逆境相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平分析
    3 討論
參考文獻(xiàn)
全文結(jié)論
創(chuàng)新點(diǎn)
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝

【相似文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2853242