葡萄是(Vtis vinifera)是一類在生產(chǎn)中具有很高栽培價值的果樹,然而,在葡萄的栽培過程中經(jīng)常會遇到鹽害、高溫、干旱、重金屬、化學毒害等逆境脅迫,這對葡萄的品質(zhì)和產(chǎn)量都造成很大的影響。生產(chǎn)上葡萄的繁殖也通常采用扦插、嫁接等無性繁殖,這既縮短了育苗所需時間還可以保持葡萄原品種性狀的穩(wěn)定性。因此,探析葡萄抗逆基因的功能并通過基因工程技術培育抗逆性強的葡萄砧木對葡萄及其他果樹的栽培具有重要的實踐意義。黃嘌吟脫氬酶(Xanthine dehydrogenase,XDH)是嘌呤代謝過程中的一種重要的酶,催化次黃嘌呤和黃嘌呤生成尿酸,植物XDH基因與各種代謝活動相關;12-氧-植物二烯酸還原酶(12-OXO-phytodienoic acid reductase,OPR)是茉莉酸(Jasmonic acid,JA)生物合成途徑中的一個關鍵酶,目前對整個植物基因組中OPR基因家族的進化及功能仍不是很清楚。本文首先對VvXDH1、VvOPR1、基因進行了生物信息學分析并預測了其功能;接著利用基于 PCR 的兩步 PTDS 法(PCR-based two-step DNA synthesis quantificational reverse-transcription),優(yōu)化并合成了葡萄(V.vinifera)的XDH1基因(VvXDH1)以及OPR1基因(VvOPR1);最后通過模式植物擬南芥和水稻對葡萄VvXDH1和VvOPR1基因進行了功能研究,以期探討VvXDH1和VvCOPR1基因的逆境脅迫應答機制以及為利用這些基因進行葡萄或其他果樹、植物的基因工程改良或表達調(diào)控提供理論依據(jù),主要研究結果如下:1.我們對VvXDH1基因的序列進行了分析發(fā)現(xiàn),VvXDH11的開放閱讀框(ORF)為4077bp,編碼一個由1358個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。推導的VvXDH1氨基酸序列與擬南芥(Arabidopsisthaliana)XDH1(AtXDH1)有76.26%的同源性;構建的同源進化樹表明,VvXDH1在進化關系上與AtXDH1同源性較高。VvXDH1三級結構與二級結構分析表明:XDH1是一種同型二聚體結構,存在兩個亞基,每個亞基包含有4個相輔因子(Molybdenum cofactor,Moco)、2個2Fe/2S中心、1個NAD結合域(即黃素腺嘌吟二核苷酸(Flavine Mononucleotide,FAD)FAD和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NADPH結合域)和1個底物結合區(qū)。VvOPR1與LeOPR1、AtOPR1蛋白經(jīng)氨基酸序列比對后發(fā)現(xiàn)同源性分別高達76.78%、70.30%;并對VvOPR1開展進化樹、三級結構分析后認為VvOPR1基因很可能不參與JA生物合成途徑而在防御逆境脅迫中發(fā)揮作用。另外,本實驗以美人指葡萄品種為試材,鑒定了 VvXDH1和VvOPR1在不同器官的表達水平,結果表明,VvXDH1和VvH1在葡萄的各個組織中均有表達,前者在葉中表達量最高,莖次之,根中表達量最低;后者在根和莖中的表達量較高,在葉中的表達量較低。2.根據(jù)NCBI登錄的VvXDH1的氨基酸序列(GenBank Accession No:XP_002285473),進行結構優(yōu)化,利用 PTDS(PCR-basedDNAsynthesis,PTDS)方法合成了來源于葡萄的XDH1基因命名為VvXDH1S。為了更進一步分析VvXDH1基因的功能,本研究構建了農(nóng)桿菌-植物雙元表達載體YN36,并讓VvXDH1S基因在擬南芥中過量表達。結果表明,過量表達VvXDH1S基因的擬南芥在不同濃度的鹽分脅迫下的萌發(fā)率、根長和鮮重較野生型顯著提高;轉(zhuǎn)基因擬南芥在200mMNaCl處理下的第5天、第15天都顯示了較高的XDH1活性,通過一系列生理指標測定,進一步證明了 VvXDH1S基因過表達株系較野生型株系更能夠在鹽分脅迫下保持體內(nèi)含水量、葉綠素、脯氨酸、脫落酸(ABA)、尿囊素的累積;減少體內(nèi)丙二醛(MDA)含量;同時保持較高的抗氧化物酶活性。隨后的實時定量PCR(qRT-PCR)分析也證明了在鹽分脅迫下,VvXDH1S過表達的擬南芥的 AtNCED3、AtZEP、AtP5CS、AtSOD、AtPOD、AtCAT基因較野生型都顯示了較高的表達水平。上述實驗結果表明,VvXDH1S基因過表達提高了植物耐鹽性而且本文就其耐鹽機理做了探討。3.根據(jù)葡萄的12-氧-植物二烯酸還原酶(OPR)基因序列設計引物,再通過基于PCR的兩步PTDS方法擴增合成了VvOPR1 基因。經(jīng)過載體構建,農(nóng)桿菌介導將VvOPR1S基因轉(zhuǎn)入到擬南芥和水稻中,并以此為材料進行水培試驗,研究了銅、鋅脅迫對轉(zhuǎn)基因植株萌發(fā)、生長、生理生化特性的影響以及銅、鋅在水稻植株體內(nèi)不同部位的積累,并運用qR-TPCR技術進行轉(zhuǎn)基因水稻抗氧化保護酶基因表達量分析以探討VvOPR1基因的功能。試驗結果顯示,在不同濃度的銅單一處理、鋅單一處理試驗下,轉(zhuǎn)VvOPR1S基因擬南芥的萌發(fā)率、根長、鮮重都顯著高于野生型擬南芥(對照),同時,轉(zhuǎn)基因水稻的生長也顯著高于野生型水稻(對照)。溶液培養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn)銅、鋅脅迫處理轉(zhuǎn)VvOPR1S基因水稻葉片中的葉綠素含量、葉綠素a和葉綠素b含量的比值(Chla/Chlb)、Fv/Fm降低且下降幅度顯著小于野生型水稻;MDA含量、電導率增大且增幅顯著小于野生型水稻;SOD、POD活性增高且增幅顯著高于野生型水稻,但CAT活性降低且降幅顯著低于野生型水稻;銅、鋅脅迫使轉(zhuǎn)基因水稻葉片的OsSOD、OsPOD、OsCAT基因的表達量增加且增幅大于野生型水稻;另外,轉(zhuǎn)基因水稻對銅、鋅的轉(zhuǎn)運能力也顯著高于野生型水稻。這些結果表明轉(zhuǎn)VvOPR1S基因水稻在重金屬銅、鋅脅迫中能夠保持較高的光合效率、重金屬轉(zhuǎn)運能力,并通過提高抗氧化保護酶基因表達水平以維持較高的酶活性來應答銅、鋅重金屬脅迫。綜合分析表明,葡萄VvXDH1、VvOPR1基因能夠提高葡萄的耐鹽、耐重金屬脅迫能力。這既為探索葡萄基因的功能開拓了新視野,又為利用基因工程、無性繁殖等手段獲得具有優(yōu)良抗逆性狀的葡萄砧木新品種提供依據(jù),同時又為植物修復鹽堿地、重金屬污染土壤提供新思路。
【學位單位】：南京農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：S663.1
【部分圖文】：

究進展??ｅ?ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，?ＸＤＨ）是一種鉬酶理作用與植物體內(nèi)的鉬酶有著緊酶（ｎｉｔｒａｔｅ?ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＮＲ）、亞硫酸ｏｘｉｄａｓｅ，?Ａ０）等４種鉬酶已在植物以尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（ＮＡ鐵氧還蛋白（Ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ）、黃素腺而發(fā)生脫氫反應的酶（Ｗｏｏｌｆｏｌｋ＆?黃嘌呤（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｅ）、黃嘌呤（Ｘ非常重要的作用（Ｚｄｕｎｅｋ－Ｚａｓｔｏｃｋ在于植物的不同器官、組織中（Ｂｍｙ有：次黃嘌呤、黃嘌呤，而嘌呤、ｌ．，２００４）。??．Ｘａｎｔｈｉｎｅ??ＮＡＤ??

Ｆｉｇ．２－１?Ｐｈｙｌｏｇｅｎｔｉｃ?ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ?ｏｆ?ＸＤＨｓ??２．１．２?ＶｖＸＤＨｌ氨基酸序列比對及二級結構分析??通過對ＸＤＨ基因家族進化樹（圖２－１）的分析，我們選取了與葡萄（Ｋ?ｖ／？丨ｙｆｅｒａ，?Ｋｖ）??相似性最高的擬南芥鷹嘴豆（Ｃ．狀／￡伽＿，〇７），以及相似性較小??的家査（５．?？７〇ｒ／，?５ｗ）和萊茵衣藻（Ｃ．?Ｃｒ）來分析ＸＤＨ蛋白結構（｜冬丨２－２）。??從圖中我們知道，ＸＤＨ蛋白主要包括如下的功能區(qū)域：２個２Ｆｅ／２Ｓ中心（鐵硫蛋白??作為電子載體），一個ＮＡＤ結合域，一個底物結合域和４個鉬輔因子（Ｍｏｃｏ）?（Ｏｒｉｅｔ??ａｌ．，?＂＾（Ｋｏｍｏｔｏｅｔａｌ．，?１９９９），?Ｍｏｃｏ?—方面作為底物結合域，在電子受體存在的條件??下使黃嘌呤轉(zhuǎn)化成尿酸；另一方面Ｍｏｃｏ還作為氧化還原部位，當處于有氧??３２??

通過采用ｑＲＴ－ＰＣＲ?（Ｒｅａｌ?Ｔｉｍｅ?Ｑｕａｎｉｔａｔｉｖｅ?ＰＣＲ）技術對基因的相對轉(zhuǎn)??錄水平進行分析從而了解該基因在葡萄＋同組織中的表達。的熒光定量ＰＣＲ??結果顯示：該基因在葡萄葉中的表達水平最高，根中的表達水平最低（圖２－３）。早期??就曾介研宄報道基因缺失的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株與對照相比，其生長和發(fā)育都??受到了影響，并且加速了葉片的衰老（Ｎａｋａｇａｗａｅｔａｌ．，２００７）。所以推測基??因與葡萄植株的抗逆性以及葉片的衰老有一定的關系。??１０?■??Ｉ?９??Ｓ?８?－?，，Ｔ，＿??Ｉ－?寵?戀??ｉ：：?＿?＿??ｉ２?？?圍?圍??”?ｒ?＾?．圓．圓—，??根／Ｒｏｏｔ?荃／Ｓｔｅｍ?葉／Ｌｅａｆ??葡萄不同組織／Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｔｉｓｓｕｅｓ?ｏｆ?ｇｒａｐｅ??圖２－３ＦｖＸＤ／／／基因在葡萄不同組織中的ｑＲＴ－ＰＣＲ表達分析??Ｆｉｇ．２－３?ＶｖＸＤＨｌ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｐａｔｔｅｒｎｓ?ｉｎ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｔｉｓｓｕｅｓ?ｏｆ?ｇｒａｐｅ?ｒｅｖｅａｌｅｄ?ｂｙ?ｑＲＴ－ＰＣＲ．??２．２ＶｖＯＰＲｌ生物信息學分析??２．２．１對ＯＰＲ家族同源基因鑒定??借助ＮＣＢＩ等公共數(shù)據(jù)庫，同時結合目前植物基因組測序方面的研究，本文分別??從藻類、苔蘚、蕨類、裸子、單子葉和雙子葉植物中選取了些許植物并鑒定了這些植??物的ＯＰＲ及其同源基因以探宄植物０ＰＲ基因家族的起源和進化。具體植物主要有蕨??類的卷柏ｍ呢／／伙而〈飾，Ｓｗ）；藻類的萊茵衣藻獅脫ｖ?ｒ命�。�，??Ｏ）；苔蘚類的小立碗蘚（尸ｈｙｓｒ麵／Ｙｒ＾／ｔｏ攸ｍ、

本文編號：2853123