葡萄是(Vtis vinifera)是一類在生產(chǎn)中具有很高栽培價值的果樹,然而,在葡萄的栽培過程中經(jīng)常會遇到鹽害、高溫、干旱、重金屬、化學(xué)毒害等逆境脅迫,這對葡萄的品質(zhì)和產(chǎn)量都造成很大的影響。生產(chǎn)上葡萄的繁殖也通常采用扦插、嫁接等無性繁殖,這既縮短了育苗所需時間還可以保持葡萄原品種性狀的穩(wěn)定性。因此,探析葡萄抗逆基因的功能并通過基因工程技術(shù)培育抗逆性強(qiáng)的葡萄砧木對葡萄及其他果樹的栽培具有重要的實(shí)踐意義。黃嘌吟脫氬酶(Xanthine dehydrogenase,XDH)是嘌呤代謝過程中的一種重要的酶,催化次黃嘌呤和黃嘌呤生成尿酸,植物XDH基因與各種代謝活動相關(guān);12-氧-植物二烯酸還原酶(12-OXO-phytodienoic acid reductase,OPR)是茉莉酸(Jasmonic acid,JA)生物合成途徑中的一個關(guān)鍵酶,目前對整個植物基因組中OPR基因家族的進(jìn)化及功能仍不是很清楚。本文首先對VvXDH1、VvOPR1、基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析并預(yù)測了其功能;接著利用基于 PCR 的兩步 PTDS 法(PCR-based two-step DNA synthesis quantificational reverse-transcription),優(yōu)化并合成了葡萄(V.vinifera)的XDH1基因(VvXDH1)以及OPR1基因(VvOPR1);最后通過模式植物擬南芥和水稻對葡萄VvXDH1和VvOPR1基因進(jìn)行了功能研究,以期探討VvXDH1和VvCOPR1基因的逆境脅迫應(yīng)答機(jī)制以及為利用這些基因進(jìn)行葡萄或其他果樹、植物的基因工程改良或表達(dá)調(diào)控提供理論依據(jù),主要研究結(jié)果如下:1.我們對VvXDH1基因的序列進(jìn)行了分析發(fā)現(xiàn),VvXDH11的開放閱讀框(ORF)為4077bp,編碼一個由1358個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。推導(dǎo)的VvXDH1氨基酸序列與擬南芥(Arabidopsisthaliana)XDH1(AtXDH1)有76.26%的同源性;構(gòu)建的同源進(jìn)化樹表明,VvXDH1在進(jìn)化關(guān)系上與AtXDH1同源性較高。VvXDH1三級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)分析表明:XDH1是一種同型二聚體結(jié)構(gòu),存在兩個亞基,每個亞基包含有4個相輔因子(Molybdenum cofactor,Moco)、2個2Fe/2S中心、1個NAD結(jié)合域(即黃素腺嘌吟二核苷酸(Flavine Mononucleotide,FAD)FAD和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NADPH結(jié)合域)和1個底物結(jié)合區(qū)。VvOPR1與LeOPR1、AtOPR1蛋白經(jīng)氨基酸序列比對后發(fā)現(xiàn)同源性分別高達(dá)76.78%、70.30%;并對VvOPR1開展進(jìn)化樹、三級結(jié)構(gòu)分析后認(rèn)為VvOPR1基因很可能不參與JA生物合成途徑而在防御逆境脅迫中發(fā)揮作用。另外,本實(shí)驗(yàn)以美人指葡萄品種為試材,鑒定了 VvXDH1和VvOPR1在不同器官的表達(dá)水平,結(jié)果表明,VvXDH1和VvH1在葡萄的各個組織中均有表達(dá),前者在葉中表達(dá)量最高,莖次之,根中表達(dá)量最低;后者在根和莖中的表達(dá)量較高,在葉中的表達(dá)量較低。2.根據(jù)NCBI登錄的VvXDH1的氨基酸序列(GenBank Accession No:XP_002285473),進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化,利用 PTDS(PCR-basedDNAsynthesis,PTDS)方法合成了來源于葡萄的XDH1基因命名為VvXDH1S。為了更進(jìn)一步分析VvXDH1基因的功能,本研究構(gòu)建了農(nóng)桿菌-植物雙元表達(dá)載體YN36,并讓VvXDH1S基因在擬南芥中過量表達(dá)。結(jié)果表明,過量表達(dá)VvXDH1S基因的擬南芥在不同濃度的鹽分脅迫下的萌發(fā)率、根長和鮮重較野生型顯著提高;轉(zhuǎn)基因擬南芥在200mMNaCl處理下的第5天、第15天都顯示了較高的XDH1活性,通過一系列生理指標(biāo)測定,進(jìn)一步證明了 VvXDH1S基因過表達(dá)株系較野生型株系更能夠在鹽分脅迫下保持體內(nèi)含水量、葉綠素、脯氨酸、脫落酸(ABA)、尿囊素的累積;減少體內(nèi)丙二醛(MDA)含量;同時保持較高的抗氧化物酶活性。隨后的實(shí)時定量PCR(qRT-PCR)分析也證明了在鹽分脅迫下,VvXDH1S過表達(dá)的擬南芥的 AtNCED3、AtZEP、AtP5CS、AtSOD、AtPOD、AtCAT基因較野生型都顯示了較高的表達(dá)水平。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,VvXDH1S基因過表達(dá)提高了植物耐鹽性而且本文就其耐鹽機(jī)理做了探討。3.根據(jù)葡萄的12-氧-植物二烯酸還原酶(OPR)基因序列設(shè)計(jì)引物,再通過基于PCR的兩步PTDS方法擴(kuò)增合成了VvOPR1 基因。經(jīng)過載體構(gòu)建,農(nóng)桿菌介導(dǎo)將VvOPR1S基因轉(zhuǎn)入到擬南芥和水稻中,并以此為材料進(jìn)行水培試驗(yàn),研究了銅、鋅脅迫對轉(zhuǎn)基因植株萌發(fā)、生長、生理生化特性的影響以及銅、鋅在水稻植株體內(nèi)不同部位的積累,并運(yùn)用qR-TPCR技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因水稻抗氧化保護(hù)酶基因表達(dá)量分析以探討VvOPR1基因的功能。試驗(yàn)結(jié)果顯示,在不同濃度的銅單一處理、鋅單一處理試驗(yàn)下,轉(zhuǎn)VvOPR1S基因擬南芥的萌發(fā)率、根長、鮮重都顯著高于野生型擬南芥(對照),同時,轉(zhuǎn)基因水稻的生長也顯著高于野生型水稻(對照)。溶液培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)銅、鋅脅迫處理轉(zhuǎn)VvOPR1S基因水稻葉片中的葉綠素含量、葉綠素a和葉綠素b含量的比值(Chla/Chlb)、Fv/Fm降低且下降幅度顯著小于野生型水稻;MDA含量、電導(dǎo)率增大且增幅顯著小于野生型水稻;SOD、POD活性增高且增幅顯著高于野生型水稻,但CAT活性降低且降幅顯著低于野生型水稻;銅、鋅脅迫使轉(zhuǎn)基因水稻葉片的OsSOD、OsPOD、OsCAT基因的表達(dá)量增加且增幅大于野生型水稻;另外,轉(zhuǎn)基因水稻對銅、鋅的轉(zhuǎn)運(yùn)能力也顯著高于野生型水稻。這些結(jié)果表明轉(zhuǎn)VvOPR1S基因水稻在重金屬銅、鋅脅迫中能夠保持較高的光合效率、重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)能力,并通過提高抗氧化保護(hù)酶基因表達(dá)水平以維持較高的酶活性來應(yīng)答銅、鋅重金屬脅迫。綜合分析表明,葡萄VvXDH1、VvOPR1基因能夠提高葡萄的耐鹽、耐重金屬脅迫能力。這既為探索葡萄基因的功能開拓了新視野,又為利用基因工程、無性繁殖等手段獲得具有優(yōu)良抗逆性狀的葡萄砧木新品種提供依據(jù),同時又為植物修復(fù)鹽堿地、重金屬污染土壤提供新思路。
【學(xué)位單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S663.1
【部分圖文】：

究進(jìn)展??ｅ?ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，?ＸＤＨ）是一種鉬酶理作用與植物體內(nèi)的鉬酶有著緊酶（ｎｉｔｒａｔｅ?ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＮＲ）、亞硫酸ｏｘｉｄａｓｅ，?Ａ０）等４種鉬酶已在植物以尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（ＮＡ鐵氧還蛋白（Ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ）、黃素腺而發(fā)生脫氫反應(yīng)的酶（Ｗｏｏｌｆｏｌｋ＆?黃嘌呤（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｅ）、黃嘌呤（Ｘ非常重要的作用（Ｚｄｕｎｅｋ－Ｚａｓｔｏｃｋ在于植物的不同器官、組織中（Ｂｍｙ有：次黃嘌呤、黃嘌呤，而嘌呤、ｌ．，２００４）。??．Ｘａｎｔｈｉｎｅ??ＮＡＤ??

Ｆｉｇ．２－１?Ｐｈｙｌｏｇｅｎｔｉｃ?ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ?ｏｆ?ＸＤＨｓ??２．１．２?ＶｖＸＤＨｌ氨基酸序列比對及二級結(jié)構(gòu)分析??通過對ＸＤＨ基因家族進(jìn)化樹（圖２－１）的分析，我們選取了與葡萄（Ｋ?ｖ／？丨ｙｆｅｒａ，?Ｋｖ）??相似性最高的擬南芥鷹嘴豆（Ｃ．狀／￡伽＿，〇７），以及相似性較小??的家査（５．?？７〇ｒ／，?５ｗ）和萊茵衣藻（Ｃ．?Ｃｒ）來分析ＸＤＨ蛋白結(jié)構(gòu)（｜冬丨２－２）。??從圖中我們知道，ＸＤＨ蛋白主要包括如下的功能區(qū)域：２個２Ｆｅ／２Ｓ中心（鐵硫蛋白??作為電子載體），一個ＮＡＤ結(jié)合域，一個底物結(jié)合域和４個鉬輔因子（Ｍｏｃｏ）?（Ｏｒｉｅｔ??ａｌ．，?＂＾（Ｋｏｍｏｔｏｅｔａｌ．，?１９９９），?Ｍｏｃｏ?—方面作為底物結(jié)合域，在電子受體存在的條件??下使黃嘌呤轉(zhuǎn)化成尿酸；另一方面Ｍｏｃｏ還作為氧化還原部位，當(dāng)處于有氧??３２??

通過采用ｑＲＴ－ＰＣＲ?（Ｒｅａｌ?Ｔｉｍｅ?Ｑｕａｎｉｔａｔｉｖｅ?ＰＣＲ）技術(shù)對基因的相對轉(zhuǎn)??錄水平進(jìn)行分析從而了解該基因在葡萄＋同組織中的表達(dá)。的熒光定量ＰＣＲ??結(jié)果顯示：該基因在葡萄葉中的表達(dá)水平最高，根中的表達(dá)水平最低（圖２－３）。早期??就曾介研宄報(bào)道基因缺失的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株與對照相比，其生長和發(fā)育都??受到了影響，并且加速了葉片的衰老（Ｎａｋａｇａｗａｅｔａｌ．，２００７）。所以推測基??因與葡萄植株的抗逆性以及葉片的衰老有一定的關(guān)系。??１０?■??Ｉ?９??Ｓ?８?－?，，Ｔ，＿??Ｉ－?寵?戀??ｉ：：?＿?＿??ｉ２?？?圍?圍??”?ｒ?＾?．圓．圓—，??根／Ｒｏｏｔ?荃／Ｓｔｅｍ?葉／Ｌｅａｆ??葡萄不同組織／Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｔｉｓｓｕｅｓ?ｏｆ?ｇｒａｐｅ??圖２－３ＦｖＸＤ／／／基因在葡萄不同組織中的ｑＲＴ－ＰＣＲ表達(dá)分析??Ｆｉｇ．２－３?ＶｖＸＤＨｌ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｐａｔｔｅｒｎｓ?ｉｎ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｔｉｓｓｕｅｓ?ｏｆ?ｇｒａｐｅ?ｒｅｖｅａｌｅｄ?ｂｙ?ｑＲＴ－ＰＣＲ．??２．２ＶｖＯＰＲｌ生物信息學(xué)分析??２．２．１對ＯＰＲ家族同源基因鑒定??借助ＮＣＢＩ等公共數(shù)據(jù)庫，同時結(jié)合目前植物基因組測序方面的研究，本文分別??從藻類、苔蘚、蕨類、裸子、單子葉和雙子葉植物中選取了些許植物并鑒定了這些植??物的ＯＰＲ及其同源基因以探宄植物０ＰＲ基因家族的起源和進(jìn)化。具體植物主要有蕨??類的卷柏ｍ呢／／伙而〈飾，Ｓｗ）；藻類的萊茵衣藻獅脫ｖ?ｒ命肌／／／／，??Ｏ）；苔蘚類的小立碗蘚（尸ｈｙｓｒ麵／Ｙｒ＾／ｔｏ攸ｍ、

本文編號：2853123