洋蔥(Allium cepa L.)是百合科蔥屬二年生草本植物,屬于異花授粉作物,是當前我國主栽蔬菜之一,種植面積廣泛。洋蔥雜種優(yōu)勢明顯,但其花器小,花期不集中,單花結籽率低,人工去雄成本高、難度大,因此洋蔥雄性不育系的選育和利用極為必要。目前有關洋蔥細胞質雄性不育的研究,多集中于細胞質雄性不育相關候選基因的篩選及分子標記,其不育性的發(fā)生機理和調控機制暫未明確。本實驗室在前期工作中,明確了洋蔥發(fā)生細胞質雄性不育的原因是絨氈層細胞的提早解離,絨氈層發(fā)育相關基因AMS(ABORTED MICROSPORES)在雄性不育系與保持系中表達量差異顯著。為了進一步探討該基因在洋蔥細胞質雄性不育發(fā)生中的功能,本研究克隆了AcAMS基因,分析其在花發(fā)育中表達量的差異,進行基因的亞細胞定位,構建AcAMS表達載體,轉化擬南芥,檢測上下游基因表達量變化,初步探討了AcAMS與洋蔥細胞質雄性不育的關系,同時構建了基于TRV的pTRV2-AcPDS載體,試圖建立洋蔥VIGS的體系。試驗結果如下:(1)以洋蔥保持系SB2四分體發(fā)育時期的花藥cDNA為模板克隆了AcAMS(KY296301)基因,該基因CDS序列全長1458 bp,推測編碼485個氨基酸,通過BLASTp比對發(fā)現(xiàn)AcAMS與AoAMS(Asparagus officinalis L.),MaAMS(Musa acuminata subsp.malaccensis),PdAMS(Phoenix dactylifera L.),EgAMS(Elaeis guineensis)的同源性均大于50%,進化樹分析顯示,AcAMS與石刁柏的AoAMS在同一分枝上,親緣關系最近。經與其他物種的AMS氨基酸序列多重比對分析發(fā)現(xiàn)AcAMS存在bHLH(basic helix-loop-helix)結構域,屬于MYC類亞家族bHLH轉錄因子。(2)利用實時熒光定量PCR技術,分析AcAMS基因的時空表達,結果表明AcAMS在花藥中表達量最高,在其他花器官中幾乎不表達,具有組織特異性,并且比較其在不育系SA2及其保持系SB2不同發(fā)育時期花藥中的表達差異,發(fā)現(xiàn)AcAMS在花粉母細胞時期及四分體時期表達差異顯著。(3)構建pGFP-AcAMS載體,采用PEG-Ga~(2+)介導法轉化擬南芥原生質體,結果驗證了該融合蛋白瞬時定位在細胞核內,與其轉錄因子核定位特性相同。(4)構建AcAMS的表達載體p1250-3301-AcAMS,利用花序侵染法遺傳轉化哥倫比亞野生型擬南芥,經PPT抗性篩選及PCR鑒定后獲得T1代植株,與野生型相比,轉基因株系表現(xiàn)為部分不育或完全不育,部分不育植株果莢短小,完全不育植株果莢極其短小且彎曲生長,轉基因株系花的雄蕊及雌蕊更長,花藥顏色黯淡且干癟,有活力的花粉粒明顯少于野生型。檢測轉基因株系中AtAMS及其上下游基因表達量的變化,結果顯示AtAMS顯著上調,AtTDF1、AtMS188顯著下調,而AtMGT5表達水平無明顯差異。同樣方法遺傳轉化ams突變體擬南芥,篩選出抗性苗。(5)構建AcAMS CRISPR/Cas9基因編輯敲除載體pHUN411-AcAMS,未來將用于洋蔥遺傳轉化。(6)以洋蔥的AcPDS部分序列(333 bp)和AcAMS部分序列(384 bp),構建基因沉默載體pTRV2-AcPDS、pTRV2-AcAMS,擬建立洋蔥VIGS轉化體系。
【學位單位】：東北農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S633.2
【文章目錄】：
摘要
英文摘要
1 引言
    1.1 研究目的與意義
    1.2 國內外研究進展
        1.2.1 植物雄性不育的類型
        1.2.2 洋蔥雄性不育的研究進展
        1.2.3 AMS基因的結構與功能
    1.3 技術路線
2 材料與方法
    2.1 試驗材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 細菌菌株與質粒載體
        2.1.3 主要試劑與儀器
        2.1.4 引物
    2.2 試驗方法
        2.2.1 AcAMS基因的克隆
        2.2.2 AcAMS生物信息學分析
        2.2.3 AcAMS基因的表達模式分析
        2.2.4 亞細胞定位
        2.2.5 植物表達載體的構建
        2.2.6 遺傳轉化
        2.2.7 轉基因擬南芥株系及ams突變體的表型分析
        2.2.8 與絨氈層發(fā)育相關基因表達模式分析
        2.2.9 CRISPR/Cas9編輯洋蔥AcAMS
        2.2.10 病毒誘導洋蔥內源基因沉默的初步研究
3 結果與分析
    3.1 AcAMS基因的克隆及生物信息學分析
        3.1.1 AcAMS基因全長的克隆
        3.1.2 AcAMS理化性質分析及結構預測
        3.1.3 AcAMS與其他AMS的同源性比對
        3.1.4 AMS進化樹分析
    3.2 AcAMS的基因表達模式分析
    3.3 亞細胞定位
        3.3.1 瞬時表達載體的構建
        3.3.2 亞細胞定位
    3.4 植物表達載體的構建及功能分析
        3.4.1 過表達載體的構建
        3.4.2 重組質粒轉化農桿菌
        3.4.3 轉基因陽性植株的篩選鑒定
        3.4.4 AcAMS功能分析
    3.5 CRISPR/Cas9編輯洋蔥AcAMS
        3.5.1 洋蔥基因組DNA的PCR及引物設計
        3.5.2 CRISPR/Cas9敲除載體的構建
        3.5.3 pHUN411-AcAMS轉化農桿菌
    3.6 洋蔥病毒誘導基因沉默體系的初步探索
        3.6.1 洋蔥AcPDS與AcAMS部分片段的克隆及載體構建
        3.6.2 pTRV2-AcPDS、pTRV2-AcAMS轉化農桿菌
4 討論
    4.1 AcAMS亞細胞定位分析
    4.2 AcAMS基因表達模式分析
    4.3 AcAMS與洋蔥細胞質雄性不育
    4.4 洋蔥VIGS體系的建立
    4.5 下一步工作計劃
5 結論
致謝
參考文獻
附錄
攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文

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1 袁巧玲;洋蔥細胞質雄性不育相關基因AcAMS的克隆及其功能分析[D];東北農業(yè)大學;2019年

本文編號：2846450