洋蔥(Allium cepa L.)是百合科蔥屬二年生草本植物,屬于異花授粉作物,是當(dāng)前我國(guó)主栽蔬菜之一,種植面積廣泛。洋蔥雜種優(yōu)勢(shì)明顯,但其花器小,花期不集中,單花結(jié)籽率低,人工去雄成本高、難度大,因此洋蔥雄性不育系的選育和利用極為必要。目前有關(guān)洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育的研究,多集中于細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)候選基因的篩選及分子標(biāo)記,其不育性的發(fā)生機(jī)理和調(diào)控機(jī)制暫未明確。本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中,明確了洋蔥發(fā)生細(xì)胞質(zhì)雄性不育的原因是絨氈層細(xì)胞的提早解離,絨氈層發(fā)育相關(guān)基因AMS(ABORTED MICROSPORES)在雄性不育系與保持系中表達(dá)量差異顯著。為了進(jìn)一步探討該基因在洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育發(fā)生中的功能,本研究克隆了AcAMS基因,分析其在花發(fā)育中表達(dá)量的差異,進(jìn)行基因的亞細(xì)胞定位,構(gòu)建AcAMS表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化擬南芥,檢測(cè)上下游基因表達(dá)量變化,初步探討了AcAMS與洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育的關(guān)系,同時(shí)構(gòu)建了基于TRV的pTRV2-AcPDS載體,試圖建立洋蔥VIGS的體系。試驗(yàn)結(jié)果如下:(1)以洋蔥保持系SB2四分體發(fā)育時(shí)期的花藥cDNA為模板克隆了AcAMS(KY296301)基因,該基因CDS序列全長(zhǎng)1458 bp,推測(cè)編碼485個(gè)氨基酸,通過(guò)BLASTp比對(duì)發(fā)現(xiàn)AcAMS與AoAMS(Asparagus officinalis L.),MaAMS(Musa acuminata subsp.malaccensis),PdAMS(Phoenix dactylifera L.),EgAMS(Elaeis guineensis)的同源性均大于50%,進(jìn)化樹(shù)分析顯示,AcAMS與石刁柏的AoAMS在同一分枝上,親緣關(guān)系最近。經(jīng)與其他物種的AMS氨基酸序列多重比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)AcAMS存在bHLH(basic helix-loop-helix)結(jié)構(gòu)域,屬于MYC類亞家族bHLH轉(zhuǎn)錄因子。(2)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),分析AcAMS基因的時(shí)空表達(dá),結(jié)果表明AcAMS在花藥中表達(dá)量最高,在其他花器官中幾乎不表達(dá),具有組織特異性,并且比較其在不育系SA2及其保持系SB2不同發(fā)育時(shí)期花藥中的表達(dá)差異,發(fā)現(xiàn)AcAMS在花粉母細(xì)胞時(shí)期及四分體時(shí)期表達(dá)差異顯著。(3)構(gòu)建pGFP-AcAMS載體,采用PEG-Ga~(2+)介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體,結(jié)果驗(yàn)證了該融合蛋白瞬時(shí)定位在細(xì)胞核內(nèi),與其轉(zhuǎn)錄因子核定位特性相同。(4)構(gòu)建AcAMS的表達(dá)載體p1250-3301-AcAMS,利用花序侵染法遺傳轉(zhuǎn)化哥倫比亞野生型擬南芥,經(jīng)PPT抗性篩選及PCR鑒定后獲得T1代植株,與野生型相比,轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)為部分不育或完全不育,部分不育植株果莢短小,完全不育植株果莢極其短小且彎曲生長(zhǎng),轉(zhuǎn)基因株系花的雄蕊及雌蕊更長(zhǎng),花藥顏色黯淡且干癟,有活力的花粉粒明顯少于野生型。檢測(cè)轉(zhuǎn)基因株系中AtAMS及其上下游基因表達(dá)量的變化,結(jié)果顯示AtAMS顯著上調(diào),AtTDF1、AtMS188顯著下調(diào),而AtMGT5表達(dá)水平無(wú)明顯差異。同樣方法遺傳轉(zhuǎn)化ams突變體擬南芥,篩選出抗性苗。(5)構(gòu)建AcAMS CRISPR/Cas9基因編輯敲除載體pHUN411-AcAMS,未來(lái)將用于洋蔥遺傳轉(zhuǎn)化。(6)以洋蔥的AcPDS部分序列(333 bp)和AcAMS部分序列(384 bp),構(gòu)建基因沉默載體pTRV2-AcPDS、pTRV2-AcAMS,擬建立洋蔥VIGS轉(zhuǎn)化體系。
【學(xué)位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S633.2
【文章目錄】：
摘要
英文摘要
1 引言
    1.1 研究目的與意義
    1.2 國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展
        1.2.1 植物雄性不育的類型
        1.2.2 洋蔥雄性不育的研究進(jìn)展
        1.2.3 AMS基因的結(jié)構(gòu)與功能
    1.3 技術(shù)路線
2 材料與方法
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 細(xì)菌菌株與質(zhì)粒載體
        2.1.3 主要試劑與儀器
        2.1.4 引物
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 AcAMS基因的克隆
        2.2.2 AcAMS生物信息學(xué)分析
        2.2.3 AcAMS基因的表達(dá)模式分析
        2.2.4 亞細(xì)胞定位
        2.2.5 植物表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2.6 遺傳轉(zhuǎn)化
        2.2.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥株系及ams突變體的表型分析
        2.2.8 與絨氈層發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)模式分析
        2.2.9 CRISPR/Cas9編輯洋蔥AcAMS
        2.2.10 病毒誘導(dǎo)洋蔥內(nèi)源基因沉默的初步研究
3 結(jié)果與分析
    3.1 AcAMS基因的克隆及生物信息學(xué)分析
        3.1.1 AcAMS基因全長(zhǎng)的克隆
        3.1.2 AcAMS理化性質(zhì)分析及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
        3.1.3 AcAMS與其他AMS的同源性比對(duì)
        3.1.4 AMS進(jìn)化樹(shù)分析
    3.2 AcAMS的基因表達(dá)模式分析
    3.3 亞細(xì)胞定位
        3.3.1 瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.3.2 亞細(xì)胞定位
    3.4 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及功能分析
        3.4.1 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.4.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
        3.4.3 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的篩選鑒定
        3.4.4 AcAMS功能分析
    3.5 CRISPR/Cas9編輯洋蔥AcAMS
        3.5.1 洋蔥基因組DNA的PCR及引物設(shè)計(jì)
        3.5.2 CRISPR/Cas9敲除載體的構(gòu)建
        3.5.3 pHUN411-AcAMS轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
    3.6 洋蔥病毒誘導(dǎo)基因沉默體系的初步探索
        3.6.1 洋蔥AcPDS與AcAMS部分片段的克隆及載體構(gòu)建
        3.6.2 pTRV2-AcPDS、pTRV2-AcAMS轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
4 討論
    4.1 AcAMS亞細(xì)胞定位分析
    4.2 AcAMS基因表達(dá)模式分析
    4.3 AcAMS與洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育
    4.4 洋蔥VIGS體系的建立
    4.5 下一步工作計(jì)劃
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文

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1 袁巧玲;洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因AcAMS的克隆及其功能分析[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2019年

本文編號(hào)：2846450