發(fā)布時間：2020-10-15 00:22

　　 甘藍(lán)(Brassica oleracea L.var.capitata L.)是一種重要的兩年生蔬菜,屬于十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種。甘藍(lán)在產(chǎn)量、品質(zhì)、抗病性、抗逆性等性狀上具有明顯的雜種優(yōu)勢。雜種優(yōu)勢育種已成為甘藍(lán)品種改良的主要方式。雄性不育突變體在甘藍(lán)雜種優(yōu)勢利用中發(fā)揮著重要作用,同時也是研究植物生殖發(fā)育調(diào)控的重要材料。83121A雄性不育材料是本課題組在育種過程中發(fā)現(xiàn)的隱性單核基因突變體。本研究以83121A為材料,研究了雄性不育發(fā)生的時期及細(xì)胞學(xué)特征,對雄性不育基因進(jìn)行了克隆與功能驗(yàn)證,同時利用轉(zhuǎn)錄組和蛋白組技術(shù)探討了雄性不育發(fā)生的分子機(jī)理,為該突變體材料在甘藍(lán)育種中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1.83121A營養(yǎng)生長正常,花朵可以正常開放,蜜腺發(fā)育正常,花蜜較多,但花藥敗育徹底,無花粉。通過石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn),83121A可正常形成四分體,四分小孢子釋放后,絨氈層提前降解,小孢子的發(fā)育停滯在單核期并最終降解;另外,利用掃描電鏡和透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),不育材料的絨氈層液泡化嚴(yán)重,幾乎檢測不到絨氈層小體的存在,且83121A小孢子從四分體釋放后無法形成花粉外壁,推測花粉外壁的缺失是小孢子敗育的主要原因。2.利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析了不育系83121A及其近等基因可育系83121B小孢子雙核期之前花蕾的基因表達(dá),共得到2881個差異表達(dá)基因,其中在83121A中上調(diào)表達(dá)的有1310個,下調(diào)表達(dá)的有1571個。通過分析花粉外壁合成相關(guān)基因在83121AB中的表達(dá),將與擬南芥CYP704B1同源的基因Bol023932確定為重要候選基因,并命名為BoCYP704B1,該基因在83121A花蕾中的表達(dá)受到嚴(yán)重抑制。3.BoCYP704B1在野生型甘藍(lán)花藥及絨氈層中特異表達(dá),其表達(dá)量在四分體時期和單核早期達(dá)到最大,以后逐漸減弱至終止;亞細(xì)胞定位結(jié)果表明該蛋白定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。BoCYP704B1與擬南芥CYP704B1、水稻CYP704B2同源性較高,目前已知CYP704B1和CYP704B2均催化中長鏈脂肪酸的羥基化,據(jù)此推測,BoCYP704B1可能編碼脂肪酸羥基化酶,參與花粉外壁合成。4.通過克隆測序發(fā)現(xiàn),83121A中BoCYP704B1基因的第一個外顯子中插入一段5424bp的Ty3-gypsy類型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子;轉(zhuǎn)座子的插入一方面抑制了該基因的表達(dá),另一方面改變了轉(zhuǎn)錄剪切位點(diǎn),使編碼蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,喪失生物學(xué)功能。5.根據(jù)BoCYP704B1突變設(shè)計基因內(nèi)分子標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析發(fā)現(xiàn),純合BoCYP704B1突變總是與雄性不育性狀連鎖,說明該基因突變是導(dǎo)致雄性不育的根本原因,開發(fā)的分子標(biāo)記可以用于不育材料的輔助選擇。另外通過轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)試驗(yàn)證明了BoCYP704B1可以恢復(fù)83121A的育性,是隱性核不育系83121A的恢復(fù)基因,可利用BoCYP704B1通過基因工程技術(shù)創(chuàng)制雄性不育保持系。6.采用高通量非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)label-free的方法對83121A和83121B小孢子雙核期之前的花蕾進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析,鑒定出1245個差異表達(dá)蛋白質(zhì),其中648個蛋白在83121A中下調(diào)表達(dá)。這些差異蛋白的生物學(xué)功能主要涉及花粉壁合成,脂肪酸代謝,氨基酸合成以及蛋白質(zhì)加工修飾,表明這些代謝途徑對于甘藍(lán)生殖發(fā)育具有重要的作用。
【學(xué)位單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S635
【部分圖文】：

業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 數(shù)分裂，產(chǎn)生四個染色體數(shù)目減半的單倍體小孢子，這 4 個小孢子由胼胝質(zhì)包裹，聚集即四分體（圖 1.1 Stage 7）。在四分體形成的同時，中間層細(xì)胞發(fā)生降解。四分體形成殊信號的調(diào)控下，絨氈層細(xì)胞開始合成胼胝質(zhì)酶，并將其分泌至藥室內(nèi)對胼胝質(zhì)壁進(jìn)行孢子從四分體中游離出來。這時的小孢子只有一個細(xì)胞核（圖 1.1 Stage 8）。絨氈層為育提供充足的水分和營養(yǎng)，單核小孢子發(fā)育過程中逐漸液泡化，產(chǎn)生中央大液泡，原先中央的細(xì)胞核被擠到一側(cè)（圖 1.2 Stage 9-10）。同時，花粉外壁逐漸形成，絨氈層慢慢 1.2 Stage 9-10）。受細(xì)胞核極性的影響，單核小孢子發(fā)生一次不均等有絲分裂，形成一的營養(yǎng)細(xì)胞包含一個較小的生殖細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，即二細(xì)胞花粉（Honys et al., 2006）。生殖步發(fā)育，并通過均等的有絲分裂產(chǎn)生兩個精細(xì)胞，此時的花粉為一個大的營養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)含胞的三細(xì)胞結(jié)構(gòu)，即三細(xì)胞花粉。隨著二細(xì)胞花粉的形成，絨氈層降解產(chǎn)生的脂類、蛋色素等物質(zhì)在花粉表面累積，形成花粉外被；隨后三細(xì)胞花粉發(fā)生脫水，便于與花粉外結(jié)合，形成成熟花粉粒（圖 1.2 Stage 11）。與此同時，藥室內(nèi)側(cè)的內(nèi)壁細(xì)胞失水干裂，脫落，釋放出成熟花粉粒（圖 1.2 Stage 12-14）。

圖 1.2 擬南芥花藥發(fā)育（二）（Sanders et al., 1999）Figure 1.2 Anther development of Arabidopsis thaliana (II)絨氈層發(fā)育及調(diào)控研究進(jìn)展氈層是在開花植物花藥中發(fā)現(xiàn)的一層位于花粉小孢子與花藥壁之間的特殊營養(yǎng)細(xì)胞（L2 層和 L3 層）的孢原細(xì)胞及連接組織分化發(fā)育而來，細(xì)胞體積通常較大并且具（Esau, 1977; Mascarenhas, 1990）。絨氈層擁有極性分泌功能，減數(shù)分裂和小孢子養(yǎng)物質(zhì)（蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類等物質(zhì)）、分解四分體所需的胼胝質(zhì)酶、花粉壁前體氈層細(xì)胞中特異合成，再分泌至藥室內(nèi)以確�；ǚ鄣恼０l(fā)育（Steiglitz, 1977; MascBedinger, 1992; Wu et al., 1997; Piffanelli et al., 1998）。研究表明，絨氈層細(xì)胞中發(fā)生異常都有可能直接引起小孢子敗育或?qū)е掠韵陆担ㄋ谓A 等，2008; Huang et al.,

圖 1.3 絨氈層發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（Liu et al., 2013）Figure 1.3 Regulatory network of tapetum development (Liu et al., 2013)分子遺傳學(xué)研究已在擬南芥和水稻等模式植物中克隆了多個對絨氈層形成和因，并構(gòu)建了絨氈層發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖 1.3）（Liu & Fan, 2013）。在花藥原形成階段，AP3、PI、AG、SPL/NZZ、EMS1/EXS、TPD1、SERK1、SERK2、BA揮了關(guān)鍵作用。在花器官 ABC 發(fā)育模型中，B 類基因 AP3/PI 和 C 類基因 A發(fā)育（Ma 2005; Wellmer et al., 2006）。此外，植物花藥發(fā)育還需要 ABC 模調(diào)控，其中較早發(fā)揮作用的基因 SPL/NZZ 是花藥孢子囊形成及細(xì)胞增殖haler et al., 1999;Yang et al., 1999）。SPL/NZZ 編碼一種 MADS 盒類轉(zhuǎn)錄因子藥發(fā)育早期表達(dá)（Ito et al. 2004; Liu et al. 2009）。在 spl/nzz 突變體中，花藥分化發(fā)育異常，無法形成小孢子及中層、絨氈層等藥壁結(jié)構(gòu)，推測在小孢子能夠通過激活下游基因來調(diào)控花藥細(xì)胞分化（Schiefthaler et al., 1999; Yang manian & Schneitz 2000, 2002）。在花藥早期發(fā)育過程中，細(xì)胞特化/分化還離不MS1/EXS、SERK1、SERK2、TPD1 等基因的調(diào)控（Canales et al. 2002; Zhao et al.; Albrecht et al. 2005; Colcombet et al. 2005; Hord et al. 2006; Mizuno et al. 20
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 孫國鳳;;利用非對稱細(xì)胞融合法向甘藍(lán)導(dǎo)入雄性不育基因[J];生物技術(shù)通報;1989年01期

2 劉娟旭;余義勛;孟成民;曹必好;雷建軍;;雄性不育基因工程及其在園藝植物中的應(yīng)用[J];生物技術(shù)通訊;2005年06期

3 S.D.Tanksley;D.Zamir;王進(jìn)濤;;番茄雄性不育基因的雙重(形態(tài)和酶)標(biāo)記[J];豫西農(nóng)專學(xué)報;1990年03期

4 陳玉輝,許向陽,李景富,李桂英;雄性不育基因工程及其在蔬菜上的應(yīng)用[J];中國生物工程雜志;2004年06期

5 鄒禮平,陳錦華;雄性不育基因TA29-Barnase轉(zhuǎn)化番茄的初步研究[J];孝感學(xué)院學(xué)報;2004年03期

6 王曉武,方智遠(yuǎn),孫培田,劉玉梅,楊麗梅;一個與甘藍(lán)顯性雄性不育基因連鎖的RAPD標(biāo)記[J];園藝學(xué)報;1998年02期

7 陳占寬;易明林;郅玉寶;李文斌;;人工植物雄性不育基因的研究進(jìn)展[J];河南農(nóng)業(yè)科學(xué);1992年06期

8 王超;安學(xué)麗;張增為;楊青;饒力群;陳信波;方才臣;萬向元;;植物隱性核雄性不育基因育種技術(shù)體系的研究進(jìn)展與展望[J];中國生物工程雜志;2013年10期

9 繆穎,伍炳華,陳德海;植物雄性不育基因工程的研究及應(yīng)用(綜述)[J];亞熱帶植物通訊;2000年01期

10 王曉武,方智遠(yuǎn),孫培田,劉玉梅,楊麗梅,莊木;一個用于甘藍(lán)顯性雄性不育基因轉(zhuǎn)育輔助選擇的SCAR標(biāo)記[J];園藝學(xué)報;2000年02期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 季家磊;甘藍(lán)83121A隱性核雄性不育基因的克隆與功能分析[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2019年

2 張新梅;甘藍(lán)顯性雄性不育基因Ms-cd1的精細(xì)定位[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2010年

3 陳冬妍;陸地棉核雄性不育基因的分子標(biāo)記定位及相關(guān)基因的克隆和功能分析[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前9條

1 張宇;大豆雄性不育基因的克隆及其功能研究[D];哈爾濱師范大學(xué);2019年

2 邢虎成;番茄ps-2雄性不育基因的PCR分析與定位[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

3 季晨飛;歐亞種葡萄遺傳圖譜構(gòu)建和雄性不育基因及部分性狀相關(guān)QTL的定位[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

4 朱莎;番茄雄性不育基因（ps-2）的分子標(biāo)記研究[D];西南大學(xué);2006年

5 肖純梅;大白菜細(xì)胞核復(fù)等位雄性不育基因定位[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

6 黃和艷;甘藍(lán)（Brassica Oleracea var. Capitata）顯性雄性不育基因分子標(biāo)記輔助育種研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2005年

7 馬棟;利用SSR分子標(biāo)記定位水稻短光敏雄性不育基因[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

8 劉高平;根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)雄性不育基因轉(zhuǎn)化柑橘的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

9 馮丹丹;一個控制擬南芥小孢子發(fā)育基因的定位和雄性不育基因啟動子的克隆[D];上海師范大學(xué);2008年

本文編號：2841413