番茄是世界上種植最廣泛的蔬菜作物之一,也是研究植物生殖發(fā)育的模式植物。前人研究表明,植物花粉發(fā)育及授粉時(shí)期對(duì)外界環(huán)境極度敏感是限制番茄坐果的主要因子,因而研究花粉發(fā)育對(duì)于番茄抗性品種的選育以及栽培技術(shù)的改良具有重要意義。促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)在植物逆境響應(yīng)與生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮多種功能。然而關(guān)于它們?cè)谥参锷成L(zhǎng)發(fā)育過程中的功能研究涉及不多。在本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中,我們分離了番茄SlMAPK家族的16個(gè)基因,初步鑒定了一批在番茄生殖發(fā)育過程中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的S1MAPK基因。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)植物特有的TDY MAPK,SlMPK20,專一作用于番茄減數(shù)分裂后花粉發(fā)育過程。SlMPK20在雄蕊中優(yōu)勢(shì)表達(dá),在雙核期花粉中表達(dá)量達(dá)到最大值。通過RANi-介導(dǎo)的對(duì)SlMPK20的抑制或利用CRISPR/Cas9對(duì)SlMPK20的敲除,可育花粉顯著性減少或完全消失,但其對(duì)植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和雌性生殖生長(zhǎng)都沒有影響。顯微觀察和基因表達(dá)分析表明,SlMPK20在單核花粉發(fā)育時(shí)期發(fā)揮功能,隨后我們利用轉(zhuǎn)錄組分析、生化分析以及分子生物學(xué)等手段研究了該基因調(diào)控番茄花粉發(fā)育的分子機(jī)制,為深入闡明番茄花粉發(fā)育的控制機(jī)理奠定了基礎(chǔ),并為利用遺傳工程技術(shù)調(diào)控番茄育性提供了理論依據(jù)。獲得的主要結(jié)果如下:(1)利用qRT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)SlMPK20在番茄不同組織中均有表達(dá),在雄蕊中優(yōu)勢(shì)表達(dá);同時(shí)SlMPK20在不同發(fā)育時(shí)期雄蕊中均有表達(dá),但在單核中后期至雙核期表達(dá)量最高。原位雜交分析發(fā)現(xiàn)在四分體至雙核期的花粉囊及花粉中均能檢測(cè)到SlMPK20的轉(zhuǎn)錄本。分離SlMPK20啟動(dòng)子并進(jìn)行GUS染色觀察發(fā)現(xiàn),SlMPK20啟動(dòng)子在擬南芥花序中表達(dá)強(qiáng)烈,進(jìn)一步冷凍切片觀察發(fā)現(xiàn)SlMPK20啟動(dòng)子信號(hào)清楚地出現(xiàn)在四分體時(shí)期至雙核期。通過原核誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)及Western-Blot分析發(fā)現(xiàn)SlMPK20能夠編碼一個(gè)水溶性的大約70.5 KDa的蛋白質(zhì);亞細(xì)胞定位證實(shí)該編碼蛋白遍在分布于細(xì)胞核、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中。(2)利用RNAi技術(shù)和CRISPR/Cas9敲除系統(tǒng)分別獲得了SlMPK20下調(diào)表達(dá)與特異敲除的番茄“Micro-Tom”轉(zhuǎn)基因株系。觀察發(fā)現(xiàn)抑制SlMPK20表達(dá)可導(dǎo)致約有80%的花粉敗育,SlMPK20的敲除導(dǎo)致花粉粒幾乎完全敗育,同時(shí)發(fā)現(xiàn)SlMPK20的過表達(dá)植株生長(zhǎng)與發(fā)育無異常;將野生型花粉授在CR-SlMPK20以及RNAi-SlMPK20轉(zhuǎn)基因植株柱頭上,轉(zhuǎn)基因植株能夠正常坐果與結(jié)籽,且種子能正常萌發(fā),表明SlMPK20的抑制或敲除對(duì)植株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)與雌性生殖生長(zhǎng)并無明顯影響,SlMPK20專一地作用于番茄雄性生殖發(fā)育過程中。細(xì)胞學(xué)觀察以及DAPI染色均發(fā)現(xiàn)SlMPK20抑制或敲除轉(zhuǎn)基因植株的花粉粒敗育發(fā)生在從單核小孢子向雙核小孢子轉(zhuǎn)變的過程中。CR-SlMPK20轉(zhuǎn)基因植株花粉粒在花粉小孢子母細(xì)胞時(shí)期至單核早期均發(fā)育正常,但在單核中期開始高度液泡化,且在單核后期加劇,至雙核期大部分細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核降解,直至成熟期花粉內(nèi)含物完全降解,花粉粒坍塌皺縮。(3)利用RNA-seq技術(shù)比較CR-SlMPK20、RNAi-SlMPK20轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株雄蕊在不同發(fā)育時(shí)期基因表達(dá)的變化。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)表明,與野生型相比,在四分體時(shí)期至單核早期(花粉敗育之前),敲除SlMPK20使大量控制糖代謝和糖運(yùn)輸?shù)幕蛞约吧L(zhǎng)素(IAA)植物激素信號(hào)傳導(dǎo)基因顯著下降;同樣,在花粉敗育顯現(xiàn)的單核中后期,下調(diào)或敲除SlMPK20導(dǎo)致大量參與糖代謝與糖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物激素(IAA和JA)合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因發(fā)生顯著性變化。然而生化分析表明蔗糖含量在四分體至單核早期、單核中后期均顯著上調(diào),內(nèi)源激素IAA與JA在單核中后期與雙核期均顯著性下降。所以,下調(diào)或敲除SlMPK20可能從轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控糖代謝與激素信號(hào)相關(guān)基因的表達(dá)水平從而誘發(fā)番茄花粉敗育。(4)酵母雙雜交及雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明了 SlMKK4與SlMPK20,SlMPK20與SlMYB32蛋白之間存在互作。且SlMPK20能夠被SlMKK4體外磷酸化。由此提出一條新的在植物花粉發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用的MAPK級(jí)聯(lián)途徑:SlMKK4-SlMPK20-SlMYB32。蛋白定量組學(xué)分析結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析結(jié)果相符,碳水化合物代謝酶在SlMPK20調(diào)控番茄減數(shù)分裂后花粉發(fā)育中發(fā)揮重要作用。SlMPK20可能通過改變SlMYB32的磷酸化水平進(jìn)而調(diào)控花粉糖代謝和糖信號(hào)相關(guān)基因、植物激素合成及信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平,從而調(diào)控番茄減數(shù)分裂后花粉發(fā)育進(jìn)程。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S641.2
【部分圖文】：

浙江大學(xué)博士學(xué)位論文?１文獻(xiàn)綜述：高等植物ＭＡＰＫｓ功能與花粉發(fā)育研宄進(jìn)展??子母細(xì)胞分化并經(jīng)過兩輪的減數(shù)分裂后（ｍｅｉｏｓｉｓ）形成四分體，隨著胼胝質(zhì)的降解，??小孢子從四分體中游離出來的過程；雄配子發(fā)生期（ｍｉｃｒｏｇａｍｅｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）即自由小??孢子減數(shù)分裂后的發(fā)育形成成熟花粉的過程（ｐｏｓｔ－ｍｅｉｏｓｉｓ）?（Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓ，?１９８９；??Ｙａｍａｍｏｔｏ?ｅｔ?ａｌ．，?２００３；?Ｄｕｒｂａｒｒｙ?ｅｔ?ａｉ，?２００５；?Ｗｉｌｓｏｎ?ａｎｄ?Ｚｈａｎｇ，?２００９；?Ｄｅｖｅｓｈｗａｒ?ｅｔ?ａｉ，??２０１１；Ｔｗｅｌｌ，２０１１；?Ｃｈｅｕｎｅｔ?ａｌ．，?２０１３．??

??＾?ｌｉｒａｎａｉｕｒｅ?ｐｏｌｌｅｎ?ｇｒａｉｎ??嫌??圖１．丨多數(shù)被子植物典型的小孢子發(fā)育過程（改自Ｍｃｘｏｒｍｋｋ?１９９３）?？??Ｆｉｇ．?１．１?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｏｆ?ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｏｇｅｎｃｓｉｓ?ｔｙｐｉｃａｌ?ｐｒｏｃｅｓｓ?ｉｎ?ｍｏｓｔ?ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍｓ?（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ??ｆｒｏｍ?Ｍｃｃｏｒｍｉｃｋ，?１９９３）．??在開花植物中，雄配子發(fā)生期被嚴(yán)格的定義為減數(shù)分裂后的花粉發(fā)育時(shí)期，游??離小孢子發(fā)育并經(jīng)過一次或兩次有絲分裂（ｍｉｔｏｓｉｓ）產(chǎn)生具有營(yíng)養(yǎng)核和生殖核的成??熟花粉粒（Ｍｃｃｏｒｍｉｃｋ，２００４）。這一過程是通過一系列復(fù)雜的步驟進(jìn)行的，己有研究??報(bào)道包括番茄在內(nèi)許多物種在細(xì)胞學(xué)水平上的進(jìn)展。然而，減數(shù)分裂后花粉發(fā)育的??分子機(jī)理在很大程度上仍是未知的。??在番茄花藥小孢子發(fā)育的過程中

植物有絲分裂蛋白激酶（ＭＡＰＫ）級(jí)聯(lián)途徑參與調(diào)控病原相關(guān)分子模式（ＰＡ相關(guān)分子模式（ＭＡＭＰ）和損傷相關(guān)分子模式（ＤＡＭＰ）（引自Ｍｅｎｇ?ａｎｄ１．４?Ｐｌａｎｔ?ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｋｉｎａｓｅ?（ＭＡＰＫ）?ｃａｓｃａｄｅｓ?ｉｎ?ｓｅｎ／ｍｉｃｒｏｂｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｐａｔｔｅｒｎ?（ＰＡＭＰ／ＭＡＭＰ）?ａｎｄ?ｄａｍａｇｅ－ａｓｌａｒ?ｐａｔｔｅｒｎ?（ＤＡＭＰ）?（Ｍｅｎｊ＊?ａｎｄ?Ｚｈａｎｇ，?２０１３）．??中，ＶＷ／欠和能夠被煙草花葉病毒（ＴＭＶ）激活�；诓《净虺聊夹g(shù)，研究發(fā)現(xiàn)ＭＡＰＫＫＫａ－ＮｔＭＥＫ２－ＳＩＰＫ／ＷＩＰＫ－ＷＲＫ導(dǎo)的超敏反應(yīng)的ＭＡＰＫ級(jí)聯(lián)途徑之一（Ｊｉｎ?ｅｗ／．，?２００３）。??■Ｓ／ＭＡＰ／Ｇ、Ｓ／ＭＡＰ尺２和Ｓ／Ｍ４／火３在植物防御生物脅迫中的作用報(bào)道（Ｋａｎｄｏｔｈ?ｅｆ?？／．，２００７；?Ｍａｙｒｏｓｅ?ｅｆ?ａ／．，２００４；?Ｓｔｕｌｅｍｅｉｊｅｒ?ｅｆ?ａ／．，

本文編號(hào)：2839101