本研究以蘋果鐵高效砧木小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)為試材,利用同源克隆的方法設(shè)計(jì)特異性引物,以克隆得到的WRKY轉(zhuǎn)錄因子為研究對(duì)象,提取小金海棠的RNA并將其逆轉(zhuǎn)錄為單鏈的cDNA,通過(guò)PCR擴(kuò)增得到MxWRKY106基因。MxWRKY106基因開放閱讀框長(zhǎng)度為1059 bp,編碼351個(gè)氨基酸,僅含有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域,且鋅指結(jié)構(gòu)為C_2H_2型,說(shuō)明其歸屬于WRKY家族的第Ⅱ類。利用軟件MEGA 7構(gòu)建MxWRKY106基因與其它物種里同源基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹,顯示MxWRKY106與蘋果(Malus domestica)MdWRKY53的同源性最高。對(duì)其進(jìn)行亞細(xì)胞定位后,結(jié)果顯示MxWRKY106蛋白定位在細(xì)胞核中。半定量RT-PCR的結(jié)果表明,MxWRKY106基因在小金海棠不同部位中的表達(dá)具有組織特異性。在正常的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)(0 h),MxWRKY106基因在所提取的器官中均有表達(dá),并且在新葉和根中的表達(dá)量最大。在低溫(2℃)、高鹽(200 mM NaCl)、缺鐵(4μM FeNa-EDTA)和鐵過(guò)量(160μM FeNa-EDTA)處理下,MxWRKY106基因的表達(dá)量隨處理時(shí)間的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,在正常的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)條件下(0 h),MxWRKY106基因在不同部位的表達(dá)情況為:新葉中的表達(dá)量最高,根次之,老葉略高于韌皮。低溫(2℃)、高鹽(200 mM NaCl)、缺鐵(4μM FeNa-EDTA)和鐵過(guò)量(160μM FeNa-EDTA)處理下,在小金海棠的新葉中,MxWRKY106基因的表達(dá)量在處理后第1 h到第24 h呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì),分別在低溫處理3 h、高鹽處理6 h、缺鐵處理9 h和鐵過(guò)量處理9 h時(shí)達(dá)到峰值。在小金海棠的根中,MxWRKY106基因的表達(dá)同樣呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì),低溫、高鹽、缺鐵和鐵過(guò)量分別在9 h、3 h、6 h、6 h達(dá)到峰值。表達(dá)量的趨勢(shì)與半定量RT-PCR的結(jié)果一致。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將小金海棠MxWRKY106基因在擬南芥中過(guò)表達(dá),篩選得到3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系,經(jīng)鹽處理7天后,野生型植株與轉(zhuǎn)基因型相比表現(xiàn)出極為明顯的黃化現(xiàn)象;經(jīng)缺鐵處理14天后,野生型擬南芥黃化矮小,根系較少,而轉(zhuǎn)基因型植株生長(zhǎng)發(fā)育正常僅少數(shù)葉片變黃;經(jīng)鐵過(guò)量處理14天后,野生型擬南芥葉片卷縮,葉色發(fā)紫,而轉(zhuǎn)基因型植株僅老葉變黃,新葉生長(zhǎng)正常。測(cè)定的與植物抗性相關(guān)的各項(xiàng)生理指標(biāo)顯示,在轉(zhuǎn)MxWRKY106基因的擬南芥各株系中CAT、SOD、POD的活性以及脯氨酸含量較對(duì)照組均升高,MDA含量較未處理組變化不大,葉綠素含量下降,與對(duì)照組的差異顯著。說(shuō)明經(jīng)高鹽、缺鐵和過(guò)量鐵處理后轉(zhuǎn)MxWRKY106基因擬南芥植株的受損程度減輕,對(duì)高鹽、缺鐵和鐵過(guò)量脅迫的抗性增強(qiáng)。綜上所述,過(guò)表達(dá)MxWRKY106基因可以增強(qiáng)擬南芥對(duì)高鹽、缺鐵和鐵過(guò)量脅迫的耐受性。
【學(xué)位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S661.1
【部分圖文】：

技術(shù)路線

總RNA的提取Fig.3-1ExtractionoftotalRNA

MxWRKY106基因全長(zhǎng)的擴(kuò)增

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本文編號(hào)：2830822