甜瓜是一種具有經(jīng)濟價值的園藝作物,由于其醇香甘甜且營養(yǎng)豐富而深受消費者喜愛,在世界各地廣泛栽培。本研究以甜瓜品種河套蜜瓜(Cucumis melo L.cv Hetao)為材料,通過對本實驗室已獲得的甜瓜果實轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析,選擇果實發(fā)育不同時期差異表達(dá)基因CmIAA16和CmGSTU12,對其進行了生物信息學(xué)分析、克隆、表達(dá)譜及遺傳轉(zhuǎn)化研究,主要結(jié)果如下:(1)通過雙向比對法,分別在甜瓜中鑒定得到18個Aux/IAA基因和48個GST基因,分析兩個家族基因編碼蛋白的分子量、等電點、氨基酸個數(shù)等理化性質(zhì),得到了該家族成員的染色體定位、基因密度、亞細(xì)胞定位、基因結(jié)構(gòu)、保守基序及蛋白系統(tǒng)進化關(guān)系的分析預(yù)測結(jié)果,結(jié)果表明CmIAA16基因可能通過參與激素信號通路從而調(diào)控激素信號通路下游基因的表達(dá),進而在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮作用;而CmGSTU12可能通過參與激素誘導(dǎo)及響應(yīng)非生物脅迫來發(fā)揮作用。(2)采用RT-PCR對目的基因進行了cDNA克隆,得到的ORF長度分別為714 bp和657 bp,構(gòu)建了其各自的超表達(dá)載體和基因編輯載體,命名為:pPIAA16、pPGSTU12、pYL-IAA16和pYL-GSTU12。(3)利用實時熒光定量PCR分析CmIAA16和CmGSTU12基因在果實不同發(fā)育時期的表達(dá)量,結(jié)果顯示CmIAA16在生長期果實中表達(dá)量最高,CmGSTU12基因在呼吸躍變期果實中表達(dá)量最高,與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相符。(4)采用子房注射法對甜瓜進行遺傳轉(zhuǎn)化,獲得T_1代轉(zhuǎn)化種子,隨機選取60粒飽滿種子并對其進行PCR檢測。從陽性率高的導(dǎo)入果實中隨機選取120粒種子播種于溫室,觀察果實表型后發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)化CmIAA16超表達(dá)載體的T_1代果實較對照組提前成熟了4.3天,初步表明CmIAA16基因具有促進果實成熟的功能,可能是甜瓜果實成熟過程的正調(diào)控因子;轉(zhuǎn)化CmGSTU12超表達(dá)載體的T_1代果實較對照組延遲成熟了5.5天,初步表明CmGSTU12基因具有抑制果實成熟的功能,可能是甜瓜果實成熟過程的負(fù)調(diào)控因子。
【學(xué)位單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S652
【部分圖文】：

am HI/Kpn I 對測序正確的克隆重組質(zhì)粒和 pPZP221 空載體分別進行雙酶切 DNA 總量 0.5 μg，限制性內(nèi)切酶各 1 μL，10×Buffer 3 μL，ddH2O 補足至 37℃，2 h。將切好的克隆重組質(zhì)粒用 1 %瓊脂糖凝膠進行電泳，利用 San純化回收試劑盒對目的片段進行回收，對切好的空載體進行純化。將目的比為 4∶1 的比例進行連接，反應(yīng)體系：目的片段 10 μL，pPZP221 載體 x μL，10×T4Buffer 2 μL，ddH2O 補足至 20 μL。反應(yīng)條件：16℃，過夜連接。桿菌 Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞進行轉(zhuǎn)化，待轉(zhuǎn)化完成后，將菌液涂在含有壯觀 LB 固體培養(yǎng)基上，倒置，37℃，過夜培養(yǎng)。挑取大小合適的單個菌落進行，對初步得到的陽性重組質(zhì)粒進行雙酶切驗證，反應(yīng)體系：1 μL Bam HI，1 quick cut Buffer，2 μL 質(zhì)粒，ddH2O 補足至 10 μL。反應(yīng)條件：37℃，1 h。脂糖凝膠電泳進行檢測，以確保目的片段與載體成功連接且大小正確。將酶克隆質(zhì)粒分別命名為：pPIAA16 和 pPGSTU12，并將正確的菌株保存?zhèn)溆?

圖 2.2 sgRNA 表達(dá)盒的構(gòu)建[90] 中間載體與引物接頭的連接；B.利用通用引物及靶位點引物 UF/RP 和 FP/gRCR 擴增；C.利用巢式特異性引物進行第二輪 PCR 以獲得完整的 sgRNA 表達(dá)Figure 2.2 Construction of sgRNA expression cassettes[90]estion/ligation with an sgRNA intermediate plasmid and target adaptor;B. First roune primer sets UF/RP and FP/gR-R,respectively. FP and RP are the adaptor forward a,and UF and gR-R are the universal primers;C. Second PCR using the nested positioprimers(Pps-R/Pgs-L、Pgs-2/Pps-2) to obtain a complete sgRNA expression casset輪 PCR步得到的稀釋產(chǎn)物為模板，UF/RP、gR/FP 為引物進行第一輪 PCR，下游引物各 2 μL、5 μL 5×Prime STAR GXL Buffer、2 μL Prime STA2 μL dNTP、補足 ddH2O 至 20 μL。反應(yīng)程序：98℃ 5min；98℃ 1 s，30 個循環(huán)；68℃ 7 min。用 1.0%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行輪 PCR輪 PCR 產(chǎn)物為模板，Pps-R/Pgs-2 或 Pps-2/Pgs-L 為引物，進行第二輪

內(nèi)蒙古大學(xué)碩士學(xué)位論文SPR/Cas9 載體的構(gòu)建 Golden Gate Ligation 方法將 sgRNA 表達(dá)盒與 pYLCRISPR/Cas9 載體連接。首對 sgRNA 表達(dá)盒與 pYLCRISPR/Cas9 載體進行酶切，再利用 T4連接酶將酶切達(dá)盒與 pYLCRISPR/Cas9 載體進行連接。反應(yīng)程序：37℃ 10 min，10℃ 5 min 個循環(huán)；37℃ 3 min，10℃ 5 min，20℃ 5 min，10 個循環(huán)。

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1 李詩萌;甜瓜CmIAA16和CmGSTU12基因在果實發(fā)育中功能的初步分析[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2019年

本文編號：2823926