荷花(Nelumbo nucifera Gaertn.)是蓮科蓮屬水生植物,為中國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一,荷花花姿優(yōu)雅,花色美麗,觀賞價(jià)值極高,且全株多個(gè)組織或器官可入藥或食用,具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前荷花雖已有紅、粉、白、黃、復(fù)色等多種花色的品種,但大多數(shù)品種為深淺不一的粉色系列,色調(diào)相對(duì)單一。迄今,有關(guān)荷花花色形成分子調(diào)控機(jī)制方面的研究較少,荷花花青素苷合成途徑相關(guān)的調(diào)控機(jī)制尚不明了,阻礙了荷花花色分子育種工作的進(jìn)一步推進(jìn)。有鑒于此,本研究以紅、粉、白、黃四個(gè)花色品種為研究對(duì)象,首先進(jìn)行了不同品種花瓣的花色表觀分析、色素含量測(cè)定,然后克隆了荷花花青素苷合成途徑中的7個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因,并分析了這些基因在不同品種不同花發(fā)育時(shí)期(蕾期、初花期、盛花期、末花期)的花瓣,同一品種不同組織(花瓣、葉、葉柄、雄蕊、心皮)中的表達(dá)差異,探討了花青素苷合成途徑關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因?qū)苫ɑㄉ纬傻恼{(diào)控機(jī)制,為進(jìn)行荷花花色改良及創(chuàng)新的分子育種奠定了重要的理論基礎(chǔ)。1不同品種不同花發(fā)育時(shí)期花瓣的花色表型分析和色素含量n,定通過(guò)分析不同品種不同花發(fā)育時(shí)期花瓣的色差值、總類黃酮含量、總花青素含量變化,可知,紅色及粉色品種表觀花色的變化與總花青素含量的變化基本一致,但白色及黃色品種各花發(fā)育時(shí)期花瓣總花青素含量幾乎為0;黃色品種不同花發(fā)育時(shí)期總類黃酮的含量高于其它品種。由此可推測(cè)紅、粉色荷花花色的形成主要受花青素積累的影響,黃色荷花花色形成與黃酮醇等積累有關(guān)。2花青素苷合成途徑中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因的克隆及序列分析采用基因克隆的方式從荷花中分離出花青素苷合成途徑中的7個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因。經(jīng)測(cè)序比對(duì),這7個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因分別為NnCHS、NnCHI、NnF3H、NnF3'H、NnF3'5'H、NnDFR、NnANS MiCHS開(kāi)放性閱讀框(ORF)為1170bp,編碼389個(gè)氨基酸；NnCHI的ORF長(zhǎng)度為630 bp,編碼209個(gè)氨基酸;NnF3H的ORF為996 bp,編碼331個(gè)氨基酸；NnF3'H的 ORF 為 1542bp,編碼 513 個(gè)氨基酸;NnF3'5'的 ORF 為 1524bp,編碼507個(gè)氨基酸;NnDFR的ORF為1029 bp,編碼342個(gè)氨基酸;NnANS的ORF為1080 bp,編碼389個(gè)氨基酸。在氨基酸序列的同源性比對(duì)分析中,荷花F3H及DFR與其他物種的同源性較低,荷花CHS、CHI、F3'H、F3'5'H、ANS與其他物種相關(guān)基因編碼的氨基酸序列的同源性較高;系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果表明,荷花F3H、ANS與其他物種相關(guān)蛋白的親緣性較遠(yuǎn)。對(duì)7個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果顯示,荷花F3'H可能為親水性蛋白；荷花CHS、CHI、F3H、DFR、ANS為酸性蛋白;荷花CHS、CHI、F3'H、DFR為穩(wěn)定性蛋白;蛋白質(zhì)的基本二級(jí)結(jié)構(gòu)由a螺旋、延伸鏈、β轉(zhuǎn)角、隨機(jī)卷曲組成;7個(gè)蛋白質(zhì)均具有相應(yīng)的蛋白結(jié)構(gòu)域。3荷花花青素苷合成途徑中關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)模式首先,通過(guò)對(duì)8個(gè)看家基因的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)荷花不同花色品種及不同花發(fā)育時(shí)期qPCR基因表達(dá)研究中最適的內(nèi)參基因?yàn)镋Fla和ACT。在確定合適內(nèi)參基因的基礎(chǔ)上,我們對(duì)荷花花青素苷合成途徑中7個(gè)結(jié)構(gòu)基因的時(shí)空表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在紅色荷花品種中,7個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)量隨著花發(fā)育期呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì),在盛花期表達(dá)量較高;粉色荷花品種中,F3'H在不同花發(fā)育期的表達(dá)量幾乎為0,其它基因則隨著花發(fā)育期表達(dá)量逐漸減少;白色荷花品種不同花發(fā)育期,DFR及ANS的表達(dá)量幾乎為0;黃色荷花品種不同花發(fā)育期的花瓣中幾乎檢測(cè)不到DFR的表達(dá),但CHI在蕾期出現(xiàn)高量表達(dá)。在不同組織間,7個(gè)基因在花瓣中的表達(dá)量均顯著高于其它組織。綜上,在荷花花青素合成途徑中,CHI、F3'H、DFR、ANS的表達(dá)量可能對(duì)花青素的合成及積累起著重要的調(diào)控作用,從而影響荷花花色的形成。
【學(xué)位單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S682.32
【部分圖文】：

色的表型逡逑花色的劃分逡逑個(gè)不同品種荷花包括紅、粉、黃、白４種花色，其中隨養(yǎng)花的開(kāi)放，粉色品變淺，最終接近白色，表現(xiàn)出明顯的褪色現(xiàn)象；紅色品種在盛花期顏色較表２－１不同品種荷花盛花期花色劃分逡逑ａｂ邋２－１邋Ｔｈｅ邋ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｌｌｏｗｅｒ邋ｃｏｌｏｒ邋ｃｕｌｔｉｖａｒｓ邋ｏｆ邋ｌｏｔｕｓ邋ｉｎｆｕｌｌ－ｏｐｅｎｉｎｇ邋ｓｔａｇｅ品種邐色系邐ＲＳＨＣＣ逡逑Ｃｕｌｔｉｖａｒ邐Ｃｏｌｏｒ邋ｓｃｒｉｅ邐＾紅色邐５９－Ｄ逡逑／ｈｏｎｇｇｕｏｈｏｎｇ逡逑yU邐６５－Ｃ逡逑Ｘｉｎｇｈｕａｌｅｎ逡逑ｒ－ｌｆｅ邐．５５－Ｃ逡逑／ｈｕｔｅｎｇｃｕ邋ｌｙｉｎｇ逡逑秣陵秋色邐２－ｂ逡逑Ｍｏｌｉｎｇｑｉｕｓｅ

逑２．３總花青素含量逡逑由總花青素含量分析結(jié)果可知（圖２－３），紅花品種的總花青素含量顯著高于其它逡逑花色品種，且隨著花發(fā)育時(shí)期，花青素的積累量先增加后減少，在盛花期積累量較大；逡逑粉花品種各花發(fā)育時(shí)期中（圖２－３邋Ｂ）含有少量的花青素，其含量也隨著花發(fā)育時(shí)期呈逡逑現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢(shì)，在初花期花青素積累達(dá)到較高。白花品種及黃花品種不逡逑同花發(fā)育時(shí)期花瓣基本不含花青素。逡逑花青素苷是植物重要的色素類群之一，其種類及含量的差異往往決定著觀賞植物逡逑不同花色的形成。在紅色荷花品種花瓣中，花色的表觀變化與花青素的含量密切聯(lián)系，逡逑含量越高，顏色越深；粉色品種花瓣中花青素含量較低，所以花色較淡；而白花品種逡逑花色的形成很可能是因?yàn)榛ò曛胁缓谢ㄇ嗨�。黃色荷花中不含有花青素，說(shuō)明其花逡逑色的形成可能與花青素?zé)o關(guān)。相似的

圖３－２關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因編碼的氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析逡逑Ｆｉｇ邋３－２邋Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ｔｒｅｅ邋ｏｆ邋ａｍｉｎｏ邋ａｃｉｄ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ邋ｏｆ邋ｋｅｙ邋ｅｎｚｙｍｅｓ逡逑２．４荷花花青素苷合成途徑關(guān)鍵酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析逡逑２．４．１蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)逡逑表３－１蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)預(yù)測(cè)逡逑Ｔａｂｌｅ邋３－１邋Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ邋ｐｈｙｓｉｃａｌ邋ａｎｄ邋ｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ邋ｏｆ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邐逡逑＿邋，邋，ｒ邐．．邋．．ｒ（，邐ｍｍ邋Ｉ．邐斗系數(shù)邐總卞１均米水性逡逑擊丨丨質(zhì)邐分ｊＷｉｉｉ丨．：邐ｗｕ侖４電點(diǎn)逡逑Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ邋Ｇｒａｎｄ邋ａｖｅｒａｇｅ邋ｏｔ逡逑Ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｎａｍｅ邋Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｗｅｉｇｈｔ邋Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ邋ｐｉ邐．逡逑ｉｎｄｅｘ邐ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ逡逑ＮｎＣＨＳ邐４２５７５．２４邐６．２４邐３７．０８邐－０．０９２逡逑ＮｎＣＨＩ邐２３３２５．６４邐５．０３邐３６．０６邐－０．１３６逡逑ＮｎＦ３Ｈ邐３７７３３．８５邐５．３２邐４６．６８邐－０．４９９逡逑ＮｎＦ３＇Ｈ邐５６４１６．３１邐８．５６邐２９．４邐０．０４０逡逑ＮｎＦ３＇５＇Ｈ邐５６３６５．８６邐９．３９邐４１．４２邐－０．０４８逡逑ＮｎＤＦＲ邐３８４７４．２８邐５．６９邐３６．２９邐－０．０９１逡逑ＮｎＡ邋ＮＳ邐４０３８６．３６邐５．６５邐４２．６３邐－０．３６７逡逑

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