目的:在庫爾勒香梨生產(chǎn)實踐中發(fā)現(xiàn),花期遭遇低溫可大幅增加脫萼果的比例,但其機制尚不清楚,前期的研究結(jié)果初步表明,kfpSPL有可能參與萼片的發(fā)育和調(diào)控。因此,克隆kfpSPL基因的DNA及其啟動子序列,預(yù)測其作用元件和功能,并檢測花期低溫對其表達的影響,可為闡明花期低溫有利于萼片的脫落分子機理奠定一定基礎(chǔ)。方法:以庫爾勒香梨花器官為材料,于盛花期(全樹50%花朵開放),采集標記‘庫爾勒香梨’樹的全花(花梗以上部分)30個,去除花瓣并從萼片和子房交界處分割成兩部分。(1)根據(jù)已經(jīng)得到的庫爾勒香梨kfpSPL基因的cDNA序列及梨基因組信息設(shè)計引物。以庫爾勒香梨基因組DNA序列為模板進行kfpSPL基因組DNA序列的擴增。用kfpSPL基因cDNA全長序列與梨基因組數(shù)據(jù)庫進行比對,獲得上游啟動子參考序列。利用參考序列設(shè)計引物,以庫爾勒香梨基因組DNA為模板經(jīng)PCR擴增獲得庫爾勒香梨kfpSPL基因上游啟動子序列。(2)根據(jù)所獲得的庫爾勒香梨kfpSPL基因的全長為模板,利用primer5.0設(shè)計實時熒光定量PCR引物,提取庫爾勒香梨總RNA使用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒RN09(Aidlab)。總RNA中的基因組DNA去除使用DNase I,RNase-free(1 U/μL),總RNA反轉(zhuǎn)錄使用PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)(TaKaRa,Japan)。以各個樣品提取的c DNA為模板,用CFX manager(Bio-Rad USA)實時定量PCR儀進行kfp SPL基因的實時定量PCR分析。(3)利用Illumina測序技術(shù)和生物信息學手段對4℃低溫處理下的庫爾勒香梨花器官進行差異基因的篩選和功能注釋。結(jié)果:(1)從庫爾勒香梨基因組DNA中擴增得到長度為3320bp的kfpSPL基因組DNA。從庫爾勒香梨基因組DNA中克隆得到上游啟動子序列,經(jīng)測序表明啟動子長為2332bp,通過生物信息學分析啟動子序列,預(yù)測順式作用元件及其功能。(2)相比較于24小時4℃處理,12小時4℃冷處理可以較為有效的提高kfpSPL基因在庫爾勒香梨初花期的相對表達量。相比較于其他兩個時長的處理,噴施冷水后6小時采樣的處理可有效的提高kfpSPL基因在庫爾勒香梨初花期的相對表達量。(3)通過Illumina高通量測序建立了庫爾勒香梨花器官在4℃低溫處理條件下8小時處理樣品和24小時處理樣品及其二者對照樣品的數(shù)據(jù),經(jīng)過數(shù)據(jù)拼接得到了96662條Unigenes,并對其在7大數(shù)據(jù)庫中進行功能注釋,其中67769條Unigenes在7大數(shù)據(jù)庫中獲得了功能注釋。樣品經(jīng)測序后共獲得轉(zhuǎn)錄本序列154020條。結(jié)論:本試驗通過PCR技術(shù)獲得了庫爾勒香梨的基因組DNA及其上游啟動子調(diào)控序列,對其二序列進行了生物信息學分析,得到了翻譯起始密碼子,并分析預(yù)測了啟動子序列的順式調(diào)控元件及功能。通過實時熒光定量PCR對低溫處理條件下的庫爾勒香梨花器官中的kfpSPL基因表達量進行檢測,通過數(shù)據(jù)分析得到使基因表達量提高的處理時長。通過Illumina高通量測序,篩選獲得了低溫處理條件下的庫爾勒香梨花器官中的差異表達基因,并在7大數(shù)據(jù)庫中進行了功能注釋。
【學位單位】：石河子大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S661.2
【部分圖文】：

2.2 kfpSPL 基因啟動子克隆及序列分析kfpSPL 基因的 cDNA 全長序列與梨基因組序列進行 Blast 比對，獲得 kfp基因啟動子模板序列，根據(jù)啟動子模板序列設(shè)計引物，以庫爾勒香梨基因組 全序列為模板通過 PCR 技術(shù)克隆獲得上游啟動子序列，經(jīng)測序表明啟動子長2332bp（圖 2-2）。將克隆得到的啟動子序列與梨全基因組序列進行本地 比對，發(fā)現(xiàn)克隆得到的上游啟動子序列的 1-796nt 和 1042-2332nt 分scaffold291.0 中 290783-289988nt 和 289990-288701nt 的同源性為 96%和 97%值均為 0。此結(jié)果可以表明 kfpSPL 基因啟動子序列與梨全基因組數(shù)據(jù)庫測碭山梨 scaffold291.0 序列存在差異。其中位于 kfpSPL 基因的啟動子序列797-1041nt 處與梨全基因組數(shù)據(jù)庫中未有比對上的相同序列，由此推測可能為庫爾勒香梨與碭山梨的品種間差異造成的。在 kfpSPL 基因的啟動子序列161-162nt 處發(fā)生插入突變，在 1345-1350nt 處發(fā)生插入突變，在 1375-1377發(fā)生插入突變，在 2129-2137nt 處發(fā)生插入突變。并且在序列中多處有單堿變發(fā)生。Mark AMark B

2.2 kfpSPL 基因啟動子克隆及序列分析kfpSPL 基因的 cDNA 全長序列與梨基因組序列進行 Blast 比對，獲得 kfp基因啟動子模板序列，根據(jù)啟動子模板序列設(shè)計引物，以庫爾勒香梨基因組 全序列為模板通過 PCR 技術(shù)克隆獲得上游啟動子序列，經(jīng)測序表明啟動子長2332bp（圖 2-2）。將克隆得到的啟動子序列與梨全基因組序列進行本地 比對，發(fā)現(xiàn)克隆得到的上游啟動子序列的 1-796nt 和 1042-2332nt 分scaffold291.0 中 290783-289988nt 和 289990-288701nt 的同源性為 96%和 97%值均為 0。此結(jié)果可以表明 kfpSPL 基因啟動子序列與梨全基因組數(shù)據(jù)庫測碭山梨 scaffold291.0 序列存在差異。其中位于 kfpSPL 基因的啟動子序列797-1041nt 處與梨全基因組數(shù)據(jù)庫中未有比對上的相同序列，由此推測可能為庫爾勒香梨與碭山梨的品種間差異造成的。在 kfpSPL 基因的啟動子序列161-162nt 處發(fā)生插入突變，在 1345-1350nt 處發(fā)生插入突變，在 1375-1377發(fā)生插入突變，在 2129-2137nt 處發(fā)生插入突變。并且在序列中多處有單堿變發(fā)生。Mark AMark B

圖 2-4 kfpSPL 基因組 DNA 序列，翻譯起始密碼子用紅色粗體標出，內(nèi)含子用紅色字體標出，黑色字體為外顯子Fig. 2-4 Sequence of KfpSPL genomic DNA. The initial password of the translation is marked inbold red, The introns are highlighted in red, and the black font is exon.18

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王博慧;孫曉霞;牛建新;;庫爾勒香梨kfpMYB及其啟動子的克隆和對激素的應(yīng)答反應(yīng)[J];園藝學報;2015年08期

2 孫曉霞;牛建新;王博慧;裴茂松;李陳靜;曹福軍;;‘庫爾勒香梨’脫萼組與宿萼組樣品差異表達基因的篩選[J];果樹學報;2015年06期

3 何子順;張虎平;阿衣木古麗·烏布力;;梨果實的“公梨”與“母梨”分析[J];中國農(nóng)學通報;2013年22期

4 官民曉;劉雪梅;張妍;劉瀛;孫豐賓;;白樺SPL8轉(zhuǎn)錄因子基因的分離及轉(zhuǎn)錄表達分析[J];南京林業(yè)大學學報(自然科學版);2013年03期

5 董芳園;張飛;王鈺婷;牛建新;;庫爾勒香梨萼片脫落與宿存相關(guān)基因的差異表達分析[J];新疆農(nóng)業(yè)科學;2013年01期

6 李明;李長生;趙傳志;李愛芹;王興軍;;植物SPL轉(zhuǎn)錄因子研究進展[J];植物學報;2013年01期

7 賈兵;朱立武;張紹鈴;;生長調(diào)節(jié)劑對‘碭山酥梨’脫萼果率和果實品質(zhì)及新梢生長的影響[J];南京農(nóng)業(yè)大學學報;2012年01期

8 劉妮;陶書田;張紹鈴;曹玉芬;吳華清;王紀忠;伍濤;;授粉品種對‘庫爾勒香梨’果實萼片宿存及品質(zhì)的影響[J];南京農(nóng)業(yè)大學學報;2011年03期

9 張飛;牛建新;葉春秀;劉娜;高靜濤;朱天丁;;庫爾勒香梨mRNA差異顯示技術(shù)體系的建立[J];石河子大學學報(自然科學版);2011年02期

10 何子順;李世強;茹仙古麗·買買提;張峰;牛建新;;庫爾勒香梨外觀品質(zhì)影響因素研究[J];中國果樹;2010年06期

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1 李疆;劉玲;匡玉疆;覃偉銘;;SA和Ca對減少庫爾勒香梨果實石細胞和提高果實品質(zhì)的影響[A];2005年全國學術(shù)年會農(nóng)業(yè)分會場論文專集[C];2005年

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1 賈兵;生長調(diào)節(jié)劑對‘碭山酥梨’果實萼片脫落與宿存的影響機制研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2012年

相關(guān)碩士學位論文 前3條

1 王炳南;小麥SPL基因的比較分析和功能研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2015年

2 馬宏超;庫爾勒香梨果實脫萼宿萼和粗皮果的顯微結(jié)構(gòu)及品質(zhì)研究[D];新疆農(nóng)業(yè)大學;2010年

3 王海燕;灰樹花GPD啟動子及藥效相關(guān)基因的克隆[D];華南熱帶農(nóng)業(yè)大學;2004年

本文編號：2811694