發(fā)布時(shí)間：2020-09-03 16:39

　　 目的:在庫(kù)爾勒香梨生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn),花期遭遇低溫可大幅增加脫萼果的比例,但其機(jī)制尚不清楚,前期的研究結(jié)果初步表明,kfpSPL有可能參與萼片的發(fā)育和調(diào)控。因此,克隆kfpSPL基因的DNA及其啟動(dòng)子序列,預(yù)測(cè)其作用元件和功能,并檢測(cè)花期低溫對(duì)其表達(dá)的影響,可為闡明花期低溫有利于萼片的脫落分子機(jī)理奠定一定基礎(chǔ)。方法:以庫(kù)爾勒香梨花器官為材料,于盛花期(全樹(shù)50%花朵開(kāi)放),采集標(biāo)記‘庫(kù)爾勒香梨’樹(shù)的全花(花梗以上部分)30個(gè),去除花瓣并從萼片和子房交界處分割成兩部分。(1)根據(jù)已經(jīng)得到的庫(kù)爾勒香梨kfpSPL基因的cDNA序列及梨基因組信息設(shè)計(jì)引物。以庫(kù)爾勒香梨基因組DNA序列為模板進(jìn)行kfpSPL基因組DNA序列的擴(kuò)增。用kfpSPL基因cDNA全長(zhǎng)序列與梨基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),獲得上游啟動(dòng)子參考序列。利用參考序列設(shè)計(jì)引物,以庫(kù)爾勒香梨基因組DNA為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得庫(kù)爾勒香梨kfpSPL基因上游啟動(dòng)子序列。(2)根據(jù)所獲得的庫(kù)爾勒香梨kfpSPL基因的全長(zhǎng)為模板,利用primer5.0設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物,提取庫(kù)爾勒香梨總RNA使用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒RN09(Aidlab)�？俁NA中的基因組DNA去除使用DNase I,RNase-free(1 U/μL),總RNA反轉(zhuǎn)錄使用PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)(TaKaRa,Japan)。以各個(gè)樣品提取的c DNA為模板,用CFX manager(Bio-Rad USA)實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行kfp SPL基因的實(shí)時(shí)定量PCR分析。(3)利用Illumina測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)手段對(duì)4℃低溫處理下的庫(kù)爾勒香梨花器官進(jìn)行差異基因的篩選和功能注釋。結(jié)果:(1)從庫(kù)爾勒香梨基因組DNA中擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為3320bp的kfpSPL基因組DNA。從庫(kù)爾勒香梨基因組DNA中克隆得到上游啟動(dòng)子序列,經(jīng)測(cè)序表明啟動(dòng)子長(zhǎng)為2332bp,通過(guò)生物信息學(xué)分析啟動(dòng)子序列,預(yù)測(cè)順式作用元件及其功能。(2)相比較于24小時(shí)4℃處理,12小時(shí)4℃冷處理可以較為有效的提高kfpSPL基因在庫(kù)爾勒香梨初花期的相對(duì)表達(dá)量。相比較于其他兩個(gè)時(shí)長(zhǎng)的處理,噴施冷水后6小時(shí)采樣的處理可有效的提高kfpSPL基因在庫(kù)爾勒香梨初花期的相對(duì)表達(dá)量。(3)通過(guò)Illumina高通量測(cè)序建立了庫(kù)爾勒香梨花器官在4℃低溫處理?xiàng)l件下8小時(shí)處理樣品和24小時(shí)處理樣品及其二者對(duì)照樣品的數(shù)據(jù),經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)拼接得到了96662條Unigenes,并對(duì)其在7大數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行功能注釋,其中67769條Unigenes在7大數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了功能注釋。樣品經(jīng)測(cè)序后共獲得轉(zhuǎn)錄本序列154020條。結(jié)論:本試驗(yàn)通過(guò)PCR技術(shù)獲得了庫(kù)爾勒香梨的基因組DNA及其上游啟動(dòng)子調(diào)控序列,對(duì)其二序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,得到了翻譯起始密碼子,并分析預(yù)測(cè)了啟動(dòng)子序列的順式調(diào)控元件及功能。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)低溫處理?xiàng)l件下的庫(kù)爾勒香梨花器官中的kfpSPL基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),通過(guò)數(shù)據(jù)分析得到使基因表達(dá)量提高的處理時(shí)長(zhǎng)。通過(guò)Illumina高通量測(cè)序,篩選獲得了低溫處理?xiàng)l件下的庫(kù)爾勒香梨花器官中的差異表達(dá)基因,并在7大數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行了功能注釋。
【學(xué)位單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：S661.2
【部分圖文】：

2.2 kfpSPL 基因啟動(dòng)子克隆及序列分析kfpSPL 基因的 cDNA 全長(zhǎng)序列與梨基因組序列進(jìn)行 Blast 比對(duì)，獲得 kfp基因啟動(dòng)子模板序列，根據(jù)啟動(dòng)子模板序列設(shè)計(jì)引物，以庫(kù)爾勒香梨基因組 全序列為模板通過(guò) PCR 技術(shù)克隆獲得上游啟動(dòng)子序列，經(jīng)測(cè)序表明啟動(dòng)子長(zhǎng)2332bp（圖 2-2）。將克隆得到的啟動(dòng)子序列與梨全基因組序列進(jìn)行本地 比對(duì)，發(fā)現(xiàn)克隆得到的上游啟動(dòng)子序列的 1-796nt 和 1042-2332nt 分scaffold291.0 中 290783-289988nt 和 289990-288701nt 的同源性為 96%和 97%值均為 0。此結(jié)果可以表明 kfpSPL 基因啟動(dòng)子序列與梨全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)測(cè)碭山梨 scaffold291.0 序列存在差異。其中位于 kfpSPL 基因的啟動(dòng)子序列797-1041nt 處與梨全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中未有比對(duì)上的相同序列，由此推測(cè)可能為庫(kù)爾勒香梨與碭山梨的品種間差異造成的。在 kfpSPL 基因的啟動(dòng)子序列161-162nt 處發(fā)生插入突變，在 1345-1350nt 處發(fā)生插入突變，在 1375-1377發(fā)生插入突變，在 2129-2137nt 處發(fā)生插入突變。并且在序列中多處有單堿變發(fā)生。Mark AMark B

2.2 kfpSPL 基因啟動(dòng)子克隆及序列分析kfpSPL 基因的 cDNA 全長(zhǎng)序列與梨基因組序列進(jìn)行 Blast 比對(duì)，獲得 kfp基因啟動(dòng)子模板序列，根據(jù)啟動(dòng)子模板序列設(shè)計(jì)引物，以庫(kù)爾勒香梨基因組 全序列為模板通過(guò) PCR 技術(shù)克隆獲得上游啟動(dòng)子序列，經(jīng)測(cè)序表明啟動(dòng)子長(zhǎng)2332bp（圖 2-2）。將克隆得到的啟動(dòng)子序列與梨全基因組序列進(jìn)行本地 比對(duì)，發(fā)現(xiàn)克隆得到的上游啟動(dòng)子序列的 1-796nt 和 1042-2332nt 分scaffold291.0 中 290783-289988nt 和 289990-288701nt 的同源性為 96%和 97%值均為 0。此結(jié)果可以表明 kfpSPL 基因啟動(dòng)子序列與梨全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)測(cè)碭山梨 scaffold291.0 序列存在差異。其中位于 kfpSPL 基因的啟動(dòng)子序列797-1041nt 處與梨全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中未有比對(duì)上的相同序列，由此推測(cè)可能為庫(kù)爾勒香梨與碭山梨的品種間差異造成的。在 kfpSPL 基因的啟動(dòng)子序列161-162nt 處發(fā)生插入突變，在 1345-1350nt 處發(fā)生插入突變，在 1375-1377發(fā)生插入突變，在 2129-2137nt 處發(fā)生插入突變。并且在序列中多處有單堿變發(fā)生。Mark AMark B

圖 2-4 kfpSPL 基因組 DNA 序列，翻譯起始密碼子用紅色粗體標(biāo)出，內(nèi)含子用紅色字體標(biāo)出，黑色字體為外顯子Fig. 2-4 Sequence of KfpSPL genomic DNA. The initial password of the translation is marked inbold red, The introns are highlighted in red, and the black font is exon.18

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2811694